Analisi di AtHIRD11 intrinseco disordine e l'associazione verso gli ioni del metallo di elettroforesi capillare ed elettroforesi capillare di affinità
Summary
Questo protocollo combina la caratterizzazione di un campione della proteina mediante elettroforesi capillare e uno screening rapido legante per ligandi caricate mediante elettroforesi capillare di affinità. È consigliabile per le proteine con una struttura flessibile, quali proteine intrinsecamente disordinati, per determinare eventuali differenze nell’associazione per diversi conformeri.
Abstract
Piante dipendono fortemente dal loro ambiente. Al fine di adeguarsi ai cambiamenti stressanti (per esempio, siccità e salinità elevata), piante superiori si evolvono classi di proteine intrinsecamente disordinate (IDP) per ridurre lo stress ossidativo e osmotico. Questo articolo utilizza una combinazione di elettroforesi capillare (CGE) e l’elettroforesi di mobilità MAIUSC affinità (ACE) al fine di descrivere il comportamento di associazione di diversi conformeri dell’AtHIRD11 di IDP da Arabidopsis thaliana. CGE viene utilizzato per confermare la purezza del AtHIRD11 e per escludere frammenti, modifiche di posttranslational e altre impurità come motivi per modelli complessi di picco. In questa parte dell’esperimento, i componenti differenti del campione sono separati da un gel viscoso all’interno di un capillare dalle loro diverse masse e rilevati con un rivelatore a serie di diodi. In seguito, il comportamento di associazione del campione verso vari ioni metallici è studiato da ACE. In questo caso, il ligando viene aggiunto alla soluzione tampone e lo spostamento nel tempo di espansione viene misurato per determinare se si è verificato un evento di associazione o no. Uno dei vantaggi di usando la combinazione di CGE e ACE per determinare il comportamento di associazione di un IDP è la possibilità di automatizzare l’elettroforesi del gel e l’analisi di associazione. Inoltre, CGE Mostra un limite inferiore di rilevamento rispetto la classica elettroforesi e ACE è in grado di stabilire la modalità di associazione di un ligando in maniera veloce. Inoltre, ACE può applicarsi anche ad altre specie cariche di ioni metallici. Tuttavia, l’uso di questo metodo per l’associazione di esperimenti è limitato nella sua capacità di determinare il numero di siti di legame. Tuttavia, la combinazione di CGE e ACE può essere adattata per caratterizzare il comportamento di associazione di qualsiasi campione di proteina nei confronti dei numerosi ligandi caricate.
Introduction
Le piante sono più dipendenti dal loro ambiente rispetto a molte altre forme di vita. Dal momento che le piante non possono spostare in altri luoghi, hanno di adeguarsi ai cambiamenti nel loro ambiente (ad esempio, siccità, freddi e alte concentrazione di sale). Di conseguenza, piante superiori sviluppato proteine dello stress specializzati come dehydrins, che si attengono a molteplici attività per ridurre lo stress cellulare legato alla elevata salinità. Queste proteine legano acqua e ioni all’interno delle cellule, ridurre lo stress ossidativo legando Cu2 +-ioni e interagire con i fosfolipidi come pure il cytoskeletons. Inoltre, associazione Zn2 +-ioni permette queste proteine di agire come fattori di trascrizione. Loro capacità di legare il Ca2 +-ioni dopo fosforilazione è stato anche segnalato1.
Multifunzionale di queste proteine è correlato all’assenza di residui dell’amminoacido idrofobo. Di conseguenza, essi mancano eventuali interazioni idrofobiche all’interno della catena peptidica e anche una struttura vincolata. Tuttavia, perché queste proteine hanno una struttura restrittiva, che può essere occupata diversi conformeri alle stesse condizioni. Pertanto, essi possono essere descritti meglio come un insieme di strutture, piuttosto che come una conformazione unica. Proteine con queste proprietà sono conosciute come intrinsecamente disordinati proteine (IDP) e sono un concetto ampiamente utilizzato per proteine dello stress e diafonia tra vie differenti in cellule eucariotiche2.
Uno di questi sfollati interni legati allo stress è AtHIRD11. È uno degli sfollati interni altamente siccità-espresso più di Arabidopsis thaliana. Quindi, i diversi conformeri possono essere separati dal loro raggio effettivo rapporto di addebitare, ed elettroforesi capillare (CE) è stato utilizzato per ulteriori indagini. Precedente ACE gli esperimenti hanno dimostrato le interazioni tra AtHIRD11 e ioni di metalli di transizione quali Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +e Ni2 +-ioni. I risultati dettagliati possono essere trovati in Hara et al. 3 e Nachbar et al. 4.
Il metodo ACE che verrà utilizzato qui si basa su nostri precedenti lavori pubblicati6. Tuttavia, l’aggiunta dell’acetanilide indicatore EOF per il campione della proteina non è adatto. AtHIRD11 Mostra modelli di vasto picco, e aggiunta l’indicatore EOF all’esempio sarebbe travestimento due picchi. Pertanto, l’indicatore è utilizzato in un oggetto run separato. Prima viene esaminato il comportamento di associazione, è confermato che i picchi rilevati durante esperimenti precedenti sono da diversi conformeri. Così, CGE è utilizzato per distinguere tra i conformisti della proteina, modificato il post-traduzionali proteina e impurità, come frammenti di AtHIRD11, di loro masse diverse. Successivamente, è indagato il comportamento di associazione del campione AtHIRD11 caratterizzata verso vari ioni metallici diversi.
Lo scopo di questo articolo è di descrivere un setup sperimentale per distinguere tra un IDP e altri componenti di un campione al fine di valutare le differenze nel comportamento associazione dei diversi conformeri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per tutti gli esperimenti di CE, la preparazione del capillare è un passo fondamentale. Trattandosi di un tubo di vetro con un diametro piccolo, si può rompere facilmente presso i punti dove il rivestimento viene rimosso quando esso viene gestita. L’installazione del vaso capillare nello strumento dovrebbe essere fatto con molta attenzione.
I passaggi critici necessari utilizzando il metodo ACE principalmente riguardano la messa a punto sperimentale. Un altro passo fondamentale è trovare i …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo grato Masakuza Hara (Research Institute of Green Science e Technology, Università di Shizuoka, Giappone) per la fornitura di campioni proteici AtHIRD11.
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
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