Análise de AtHIRD11 desordem intrínseca e ligação para íons metálicos por eletroforese em Gel capilar e afinidade de eletroforese capilar
Summary
Este protocolo combina a caracterização de uma amostra de proteínas por eletroforese em gel capilar e uma triagem rápida ligação para ligantes carregadas por eletroforese capilar de afinidade. É recomendável para proteínas com uma estrutura flexível, tais como proteínas intrinsecamente desordenadas, para determinar as diferenças de ligação para diferentes conformistas.
Abstract
As plantas são fortemente dependentes de seu ambiente. A fim de ajustar-se às mudanças estressantes (por exemplo, a seca e alta salinidade), plantas superiores evoluem classes de proteínas intrinsecamente desordenadas (deslocados internos) para reduzir o stress oxidativo e osmótico. Este artigo utiliza uma combinação de electroforese em gel capilar (CGE) e electroforese de afinidade de turno de mobilidade (ACE) para descrever o comportamento de vinculação de conformistas diferentes de AtHIRD11 o IDP da Arabidopsis thaliana. CGE é usado para confirmar a pureza da AtHIRD11 e para excluir fragmentos, modificações do posttranslational e outras impurezas como razões para padrões complexos de pico. Nesta parte do experimento, os componentes de amostra diferentes são separados por um gel viscoso dentro de um capilar por suas massas diferentes e detectados com um detector de matriz de diodo. Depois disso, o comportamento de vinculação da amostra para vários íons metálicos é investigado pela ACE. Neste caso, o ligante é adicionado à solução tampão e a mudança no tempo de migração é medida para determinar se ocorreu um evento de ligação ou não. Uma das vantagens de usar a combinação de CGE e ACE para determinar o comportamento de vinculação de um IDP é a possibilidade de automatizar a electroforese do gel e o ensaio. Além disso, o CGE mostra um menor limite de detecção do que a eletroforese em gel de clássica e ACE é capaz de determinar o modo de ligação de um ligante de forma rápida. Além disso, ACE também pode ser aplicado a outras espécies carregadas de íons metálicos. No entanto, o uso desse método para experimentos de associação é limitado em sua capacidade de determinar o número de locais obrigatórios. No entanto, a combinação da CGE e ACE pode ser adaptada para caracterizar o comportamento de vinculação de qualquer amostra de proteína para inúmeros ligantes carregadas.
Introduction
As plantas são mais dependentes de seu ambiente do que muitas outras formas de vida. Uma vez que as plantas não podem mover-se para outros lugares, eles têm para se adaptarem às mudanças em seu ambiente (por exemplo, seca, fria e alta concentração de sal). Por conseguinte, plantas superiores desenvolveram proteínas de estresse especializadas como dehydrins, que cumprir tarefas múltiplas para reduzir o estresse de célula relacionada com alta salinidade. Estas proteínas ligam íons e água no interior das células, reduzir o estresse oxidativo vinculando Cu2 +-íons e interagir com fosfolipídios, bem como o citoesqueleto. Além disso, a vinculação Zn2 +-íons permite que estas proteínas que atuam como fatores de transcrição. Sua capacidade de Ca2 +-íons após fosforilação também tem sido relataram que1.
O multifuncional comportamento destas proteínas está relacionado com a ausência de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Por conseguinte, falta-lhes qualquer interações hidrofóbicas dentro da cadeia peptídica e, também, uma estrutura restrita. No entanto, porque estas proteínas possuem uma estrutura restritiva, eles podem ocupar diferentes conformistas nas mesmas condições. Portanto, eles podem ser descritos melhor como um conjunto de estruturas em vez de uma única conformação. Proteínas com essas propriedades são conhecidas como intrinsecamente desordenado proteínas (deslocados internos) e são um conceito amplamente utilizado para proteínas de estresse e crosstalk entre diferentes caminhos em pilhas eukaryotic2.
Dentre estes deslocados internos relacionados com o stress é AtHIRD11. É uma de Arabidopsis thalianada maioria altamente seca-expresso deslocados. Portanto, os conformistas diferentes podem ser separados por seu raio eficaz de cobrar taxa, e eletroforese capilar (CE) tem sido utilizado para mais investigações. Experiências anteriores de ACE demonstraram que as interações entre os íons de metais de transição como Cu2 +– Zn2 +-, Co2 +e Ni2 +e AtHIRD11-íons. Os resultados detalhados podem ser encontrados no Hara et al . 3 e Nachbar et al 4.
O método ACE que será usado aqui baseia-se em nossos trabalhos anteriormente publicados6. No entanto, a adição da acetanilida de marcador EOF para a amostra de proteína não é adequada. AtHIRD11 mostra padrões de pico largo, e adicionar o marcador EOF para a amostra seria disfarçar dois picos. Portanto, o marcador é usado em uma execução separada. Antes do comportamento de vinculação é examinado, confirma-se que os picos encontrados durante as experiências anteriores são de diferentes conformistas. Assim, CGE é usado para distinguir entre os conformistas de proteína, o borne-translational modificado, proteína e as impurezas, tais como fragmentos de AtHIRD11, por suas massas diferentes. Posteriormente, o comportamento de vinculação do exemplo AtHIRD11 caracterizadas para vários diferentes íons metálicos é investigado.
O objetivo deste artigo é descrever uma instalação experimental para distinguir entre um IDP e outros componentes de uma amostra para avaliar as diferenças entre o comportamento de vinculação de conformistas diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para todos os experimentos do CE, a preparação do capilar é uma etapa crítica. Uma vez que é um tubo de vidro com um diâmetro pequeno, pode facilmente quebrar nos pontos onde o revestimento é removido quando está a ser tratado. A instalação do capilar dentro do instrumento deve ser feita com muito cuidado.
Os passos críticos envolvidos em usando o método ACE principalmente referem-se à instalação experimental. Outro passo crítico é encontrar os parâmetros de injeção de amos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grato agradecemos Masakuza Hara (Instituto de pesquisa de verde ciência e tecnologia, Universidade de Shizuoka, Japão) para fornecer as amostras de proteínas AtHIRD11.
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
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