우리 nicotinatmide 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NAD(P)H) + H + 조직 샘플에서 직접 생성 하는 효소 효소 활동의 공간적 분포를 매핑하기 위한 프로토콜 설명.
공간과 시간에 효소 활동을 매핑 하는 것이 정상 조직과 질병에서 셀 동작의 분자 기초를 이해 하기 위한 중요 합니다. 신진 대사 활동 분석 실험 현장에 는 조직 내에서 신진 대사 활동의 공간적 분포에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 여기 조직 샘플에서 직접 효소 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 젖 산 효소 포도 당 소비 호 기성 또는 혐 기성 해당 분해를 통해 에너지로 변환 하는 것입니다 여부의 중요 한 결정 이다. 젖 고 나드를 포함 하는 솔루션은 냉동된 조직 섹션에 제공 됩니다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD) NADH를 검출 될 수 있다 양성자의 감소에 따라 제공 하는 동시에 변환 하는 동안 높은 젖 산 효소 활동에 포함 된 셀 pyruvate에 제공 된 젖 산을 변환 됩니다. nitrotetrazolium 블루 침전으로 시각화 formazan 블루. 우리는 마우스 피부에서 젖 산 효소 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜을 적용, 우리는 젖 산 효소 활동은 높은 무부하 머리 여 포 줄기 세포는 피부 내에 발견. 마우스 미 발달 섬유 아 세포 보다 배양된 미 발달 줄기 세포에서 높은 얼룩 공개 교양된 마우스 배아 줄기 세포를 적용 하는 프로토콜. 갓 절연된 마우스 대동맥의 분석 계시 수직 대동맥 평활 근 세포에 얼룩. 제공 하는 방법론 공간적으로 냉동 또는 신선한 조직에 양성자를 생성 하는 효소의 활동을 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.
있는 효소는 높은 또는 낮은 활동 조직 내의 위치를 이해 하는 것은 이해 개발 및 생리학에 대 한 필수적입니다. 사본 또는 단백질 레벨은 효소 활동에 대 한 대리 모 알선으로 자주 사용 된다. 이러한 연구는 유익 수 있습니다, 그들은 포스트 번역 상 수정, 단백질 복합물, 또는 효소의 subcellular 지 방화의 존재 하는 효소의 활동을 결정 하기 위한 중요 한 수 있는 정보를 제공 하지 않습니다. 효소 활동은 직접 측정 하는 경우 더 이상 높은 또는 낮은 활동은 조직 내에서 혼합물 또는 셀의 공간 분포 내에서 개별 셀에 대 한 정보를 포함 하는 무 균된 단백질 lysates에 자주 모니터링 합니다.
여기는 조직 샘플 내에서 효소 활동의 공간 배급을 매핑하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 방법론은 tetrazolium 염 dehydrogenases, reductases, 및 냉동된 조직1에서 oxidases의 활동을 지역화를 사용할 수 있습니다 설명 하는 이전 연구를 기반으로 합니다. 이러한 방법으로, 물 불용 성 formazan 형성 때 양성자 tetrazolium 소금2,3에 전송 됩니다. 포도 당-6-인산 효소는 NADPH와 양성자, 생성 하 고 tetrazolium 활동 감지 되었습니다. 포도 당-6-인산 효소는 유럽 넙치 hepatocytes4, 폐5 의 2 형 폐 포 세포와 신장5nephrons에서에서 모니터링 되었습니다. Tetrazolium 소금 또한 냉동된 조직6transketolase 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 비슷한 접근 방식은 최근 인접 한 슬라이드7에 동일한 조직에 여러 개의 dehydrogenases의 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었다.
여기 tetrazolium 염을 사용 하 여 (그림 1) 젖 산 효소 활동의 공간적 분포를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 젖 산 효소 분해 젖이 나올, 하 고 역 반응에 의해 생성 된 pyruvate를 변환할 수 있습니다. 젖 산 효소 활동은 결과적으로 그것의 분 비로 젖이 나올 대 tricarboxylic 산 주기로 pyruvate의 입구를 결정 하는 중요 한 이다. 젖 산 수치 종종 다양 한 질병 이나 상해는 손상 된 세포와 효소가 릴리스 되었습니다 나타낼 수 있기 때문에 암8,,910를 포함 하 여 질병을 진단 하는 데 사용 됩니다.
4 젖 산 효소 유전자를 있다: LDHA, LDHB, LDHC, 및 LDHD11. LDHA와 LDHB는 초기 LDHA 유전자12의 중복에서 발현 생각 된다. LDH는 tetramer로 활성 이며 LDHA 및 LDHB homotetramers와 함께 heterotetramers를 형성할 수 있다. LDHA LDHB는 젖 산에 대 한 높은 선호도를 보고 pyruvate13우선적으로 젖 산을 변환 하는 동안 pyruvate에 대 한 높은 선호도가지고 보고 있다. LDHA 발기인 HIF1α, cMYC 및 FOXM1 녹음 방송 요인11에 대 한 바인딩 사이트를 포함 되어 있습니다. 또한, 같은 많은 다른 glycolytic 효소14,15, LDH 포스트 번역 상 수정에 의해 수정할 수 있습니다. 섬유 아 세포 성장 인자 수용 체 1 Y10 tetramer 형성을 촉진, 또는 NADH 기질 바인딩16촉진 Y83 LDHA phosphorylate 수 있습니다. LDHA acetylated17수도 있습니다. 이러한 이유로, LDH 활동의 완전 한 이해 LDH 단백질 수준, 하지만 효소의 활동 뿐만 아니라 모니터링 해야 합니다.
우리가 여기에 제시 하는 메서드와 다른 접근 젖 산 효소 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 무 균 단백질 lysate spectrophotometrically 젖 산 효소 활동을 모니터링할 수 있습니다. NADH 생성 젖 산 pyruvate 변환으로 측정 될 수 있다 340 흡 광도에 따라 nm, 동안 pyruvate는 젖 산18변환으로 NADH의 실종을 모니터링할 수 있습니다. 젖 산 효소 활동은 또한 자기 공명 영상 (MRI)와 모니터링 되었습니다. 13 C-pyruvate를 관리할 수 있습니다 하 고 젖이 나올에 pyruvate의 변환의 비율으로 감시 될 수 있다 [1-13C] 젖이 나올 / [1-13C] pyruvate. 상승의 비율 [1-13C] 젖이 나올 / [1-13C] pyruvate 암 조직19에서 관찰 되었습니다. MRI-기반 접근 정상에 젖 산 효소 활동과 질병 조직에 정보를 제공할 수 있습니다, 하는 동안 방법론 특정 셀에 활동 수준을 결정 하는 데 필요한 해상도 있지 않습니다. 여기에 제공 된 방법론은 조직 영역에서 단일 셀에도 젖 산 효소 활동에 정보를 제공할 수 있습니다.
현장에서 활동 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 젖 산 효소의 활동은 마우스 피부20의 머리카락 뿌리 줄기 세포에서 높은 발견. 우리 또한 사용 방법이 경작된 한 배아 줄기 세포에서 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하 고 활동은 피더 계층 보다는 줄기 세포에서 발견. 마지막으로, 우리는 신선한 마우스 대동맥에서 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하 고 부드러운 근육 세포에 얼룩이 관찰. 우리 여기 냉동된 마우스 피부에서 젖 산 효소 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.
여기 설명 하는 방법은 젖 산 효소 또는 다른 세포 유형 조직 내에서 또는 시간이 지남에 따라 조직의 다른 부분에서에서 NADH 또는 NADPH를 생성 하는 다른 대사 효소의 활동을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 젖 산 효소, 종양 줄기 세포의 생물학을 이해 하기 위한 중요 한 효소 이며 개별 셀에서 젖 산 효소 활동을 모니터 하는 능력이이 효소의 기능에 중요 한 통찰력을 제공할 것입니다.
<…The authors have nothing to disclose.
HAC 리 타 알 렌 재단 (http://www.ritaallenfoundation.org)의 밀 튼 중 카셀 학자 이었다. 이 작품에서 국립 연구소의 일반 의료 과학 R01 GM081686, R01 AR070245, 국립 연구소의 종합 의료 과학 R01 GM0866465, Eli와 Edythe 넓은 재생 의학 센터 & 줄기 세포 연구 (HAC에 교부 금에 의해 투자 되었다 로즈 언덕 및 Hal Gaba 상), 아와 HAC Jonsson 종합 암 센터에서 상을 아이리스 칸토어 여자 건강 센터/UCLA CTSI NIH 그랜트 UL1TR000124, 백혈병 림프 종 사회 영향. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 P50CA092131에서 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. HAC는 Eli & Edythe 넓은 센터의 재생 의학 및 줄기 세포 연구, UCLA 분자 생물학 연구소, UCLA 생물 정보학 각 부처간 프로그램의 회원입니다.
Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
Dry Ice | |||
Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
vortex | |||
Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
Light microscope |