Summary

Cella singola analisi di Immunophenotype e produzione di citochine nel sangue periferico intero tramite citometria a massa

Published: June 26, 2018
doi:

Summary

Qui descriviamo un approccio proteomico di singola cellula per valutare immunitario fenotipica e funzionale (induzione di citochine intracellulari) alterazioni nei campioni di sangue periferico intero, analizzati tramite citometria a massa.

Abstract

Citochine svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi delle malattie autoimmuni. Quindi, la misurazione dei livelli di citochine è stata al centro di molteplici studi nel tentativo di capire i meccanismi precisi che portano alla rottura della tolleranza al self e autoimmunità successive. Approcci finora sono stati basati sullo studio di un aspetto specifico del sistema immunitario (un singolo o pochi tipi di cellule o citochine) e non offrono una valutazione globale della malattia autoimmune complessa. Mentre studi basati su sieri di pazienti hanno offerto importanti intuizioni autoimmunità, non forniscono la fonte cellulare specifica delle citochine dysregulated rilevate. Un approccio globale di singola cellula per valutare la produzione di citochina in più sottoinsiemi di cellule immuni, all’interno del contesto di “intrinseco” plasma paziente-specifici fattori, di circolazione è descritto qui. Questo approccio consente il monitoraggio del fenotipo immune paziente-specifici (marcatori di superficie) e funzione (citochine), sia nella sua nativa “intrinseco patogeni” malattia stata, o in presenza di agenti terapeutici (in vivo o ex vivo).

Introduction

Le malattie autoimmuni sono delle principali cause di morbilità e mortalità che colpisce 3-8% della popolazione. Negli Stati Uniti, disordini autoimmuni sono tra le principali cause di morte tra le donne giovani e di mezza età (età < 65 anni)1,2. Disordini autoimmuni sono caratterizzati dalla presentazione clinica eterogenea e diversificati processi immunologici sottostanti. Lo spettro di eterogeneità è ben rappresentato in diversi disturbi, come la partecipazione unita nell’artrite reumatoide (RA) e malattia neurologica nella sclerosi multipla (MS). Tuttavia, questo livello di eterogeneità è esemplificato anche all’interno di un singolo disordine, come il lupus eritematoso sistemico (Les): alcuni pazienti possono presentare con patologia renale, mentre gli altri soffrono di coinvolgimento ematologico o misto3.

Immunopatogenesi sottostante nei disordini autoimmuni rispecchia l’eterogeneità clinica, che coinvolge e iper-attivazione automatica di più sottoinsiemi delle cellule immuni innate ed adattabili e dysregulated concomitante produzione di citochine. Mentre citochine svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi della malattia autoimmune, comprendere il loro ruolo specifico nel meccanismo di malattia ha dimostrato di essere impegnativo. Le citochine sono caratterizzate da pleiotropia (una citochina può avere molteplici effetti su diversi tipi di cellule), ridondanza (citochine multiple possono avere lo stesso effetto), la dualità (una citochina può avere effetti pro – o anti – infiammatori in condizioni diverse), e plasticità (citochine possono essere modellate in un ruolo diverso da quello “originale”, a seconda dell’ambiente)4,5,6. Di conseguenza, metodi a livello di popolazione non possono distinguere le risposte cellulari eterogenee per la stessa “milieu citochinico”. Allo stesso modo, progettazione degli studi che si concentrano su un aspetto specifico del sistema immunitario (una citochina o tipo unicellulare), non offrono una valutazione globale di tutti gli elementi coinvolti nella malattia autoimmune complessa. Mentre studi basati su sieri di pazienti hanno offerto importanti intuizioni autoimmunità, non forniscono la fonte cellulare specifica delle citochine dysregulated rilevate.

Recentemente, abbiamo sviluppato un approccio di proteomica di singola cellula per valutare contemporaneamente più tipi di cellule immunitarie e rilevare le loro varie perturbazioni di citochina nell’ambiente del paziente specifico “patogeni” plasma sanguigno periferico fattori circolanti. Il flusso di lavoro descritto qui è caratterizzato dall’uso di campioni di sangue intero periferico intatto, al contrario di cellule mononucleari di sangue periferico isolato (PBMCs). Sangue periferico intero rappresenta il veicolo più fisiologicamente rilevante per studiare la malattia immune-mediata sistematica, compreso globuli 1) non-mononucleari spesso coinvolti nella malattia autoimmune (cioè, neutrofili, piastrine) e 2) del plasma circolazione di fattori, quali gli acidi nucleici, i complessi immuni e citochine, che hanno ruoli di attivazione immunitario. Per catturare il “intrinseco patogeni” produzione dysregulated di citochina, sangue periferico campioni vengono elaborati immediatamente dopo il prelievo del sangue (T0, tempo zero) e dopo 6 h di incubazione a 37 ° C (temperatura corporea fisiologica) con un trasporto di proteine inibitore in assenza di qualsiasi condizione di stimolazione esogena (T6, tempo 6 h), per rilevare la produzione di citochine (accumulo, T6-T0) che rifletta lo stato di malattia “intrinseca” (Figura 1). Per studiare processi dysregulated che riflettono sopra o sotto-attivazione di vie di segnalazione coinvolte nelle risposte immunitarie pertinenti alla malattia, campioni di sangue periferici sono trattati (6 ore di incubazione a 37 ° C con un inibitore della proteina di trasporto) con un esogeno stimolando la condizione che riflette la patogenesi della malattia, quali gli agonisti del recettore Toll-Like (TLR) nel caso di SLE (T6 + R848, tempo 6 h con R848 1 µ g/mL), per rilevare la produzione di citochine che riflettesse una risposta agli acidi nucleici (confronto tra T0 vs T6 vs T6 + R848, Figura 1). Per studiare gli effetti immunomodulatori di terapie disponibili ex vivo, come si riferiscono ai processi dysregulated immune preciso per specifici pazienti, campioni di sangue periferici sono trattati con un inibitore JAK alle pertinenti terapeutico concentrazione (qui, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tempo 6h con 5 uM ruxolitinib), per rilevare le modifiche nello stato di malattia “intrinseca” in risposta al farmaco (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Figura 1). Un inibitore JAK è stato scelto per questo studio perché gli inibitori JAK sono stati indicati per avere successo nel trattamento di malattie autoimmuni come ra

Per valutare contemporaneamente i processi di dysregulated sopra descritti in più sottoinsiemi di cellule immunitarie, i campioni di sangue periferico da SLE pazienti e controlli sani sono stati trattati come descritto in precedenza e analizzati mediante citometria a massa. Citometria a massa, noto anche come Cytometry-Time-Of-Flight, offre analisi unicellulare di oltre 40 parametri senza problemi di spettrale si sovrappongono7,8,9. Questa tecnica utilizza terre rare isotopi del metallo sotto forma di ioni metallici solubili come tag associato agli anticorpi, invece di fluorofori10. Ulteriori dettagli riguardanti la piattaforma tecnologica di citometria a massa (cioè, tuning e calibrazione, acquisizione di esempio) possono essere trovati in Leipold et al e McCarthy et al. 11 , 12 l’alta-dimensionalità di massa cytometry consente la misura simultanea delle citochine multiple in tutta sottoinsiemi delle cellule immuni innate ed adattabili con granularità di singola cellula (Tabella materiali).

Corrente convenzionale di parametri clinici e di laboratorio spesso non sono sufficientemente specifiche per la rilevazione di attività di malattia in corso o la risposta a specifici immunomodulatori13, che riflette la necessità di delineare meglio il sistema immunitario sottostante o sensibili modifiche che guidano le fiammate. Data la pervasività della citochina disregolazione nella malattia autoimmune, hanno una pletora di approcci terapeutici che utilizzano gli anticorpi o piccoli inibitori molecolari targeting citochine o segnalazione di proteine coinvolte nella regolazione della produzione di citochine recentemente è emerso. Nella sua forma base, l’approccio analitico di sangue periferico qui descritto fornisce una piattaforma per identificare dysregulated paziente-specifici sottoinsiemi di cellule e la loro produzione di citochina anormale nella malattia autoimmune con le manifestazioni sistematiche. Questa metodologia permette per la personalizzazione delle scelte terapeutiche come citochine dysregulated specifici possono essere identificate, trattamento specifico di opzioni possono essere esaminato ex vivo per valutare la loro capacità di immunomodulate il paziente malattia specifica processo.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati da il Colorado più istituzionale Review Board (COMIRB) dell’Università del Colorado. Tutte le procedure descritte qui sotto dovrebbero essere effettuate in un cappuccio sterili per coltura, salvo diversa indicazione, con puntali filtrata, e tutti i reagenti filtrata. 1. preparazione dei reagenti per la lavorazione del sangue intero periferico Preparare ruxolitinib stock aliquote (10 – 15 μL/flaconcino monouso) a 10mm diluendo il …

Representative Results

Nella figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro per la stimolazione e l’elaborazione dei campioni di sangue periferico, compresa l’assegnazione di aliquote del campione di sangue, temporizzazione dell’aggiunta di agenti di stimolazione, proteina trasporto inibitore cocktail e incubazione volte fino alla lisi di globuli rossi (RBC) e la fissazione. La scelta degli agenti stimolanti dipenderà le vie di segnalazione e citochine che sono mirate per la valuta…

Discussion

Qui descriviamo un romanzo, unicellulare, approccio proteomico per valutare contemporaneamente più tipi di cellule immunitarie e rilevare le loro varie perturbazioni di citochina nell’ambiente del paziente specifico “patogeni” plasma sanguigno periferico fattori circolanti. Questo metodo utilizza sangue intero periferici come il veicolo analitico e citometria a massa come lo strumento per la valutazione di anomalie fenotipiche e funzionali cellulari immuni. Il metodo è facilmente applicabile a studi umani e topi<sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Aimee Pugh-Bernard per suo input intellettuale e utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal Boettcher Foundation Webb-Waring Biomedical Research Award e il premio numero K23-1K23AR070897 dal NIH per Elena W.Y. Hsieh. Lei era anche supportata da premio numero K12-HD000850 da Eunice Kennedy Shriver National Institute di salute del bambino e lo sviluppo umano e la Lucile Packard Foundation per la salute dei bambini, Stanford CTSA UL1 TR001085 e ricerca di salute dei bambini Istituto della Stanford University.

Materials

Ruxolitinib Santa Cruz SC-364729A Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM
R848 Invivogen tlrl-r848-5 Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL
LPS-EK Invivogen tlrl-eklps Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL
Sterile PBS Lonza 17-516F
Lyse/Fix Buffer BD biosciences 558049 Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)
 BD Phosflow perm/wash buffer I BD biosciences 557885 Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)
RPMI Gibco 21870-076
Sodium Azide (NaN3) Sigma-Aldrich S-8032 Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002
Protein Transport Inhibitor (PTI) eBiosciences 00-4980-93 Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X
DNA Intercalator Fluidigm 201192B Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM
Cell Staining Media (CSM) PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3
MaxPar Barcode Perm Buffer Fluidigm 201057 Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
20-plex Pd Barcode Set Fluidigm S0014 Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
EQ TM Four Element Calibration Beads Fluidigm 201078 Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
16% MeOH-free Formaldehyde Solution Thermo 28908 Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)
Sterile round bottom polystyrene tubes VWR 60818-496 Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Polypropylene cluster tubes Light Labs A-9001 Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Helios CyTOF instrument Fluidigm Helios All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies used for Mass Cytometry
Surface markers
CD1c Biolegend L161 Mass: 161
CD3 BD UCHT1 Mass: 144
CD4 Biolegend SK3 Mass: 174
CD7 BD M-T701 Mass: 149
CD8 Biolegend SK1 Mass: 142
CD11b Fluidigm ICRF44 Mass: 209
CD11c BD B-ly6 Mass: 152
CD15 BD HI98 Mass: 115
CD14 Biolegend M5E2 Mass: 154
CD16 eBioscience/Thermo B73.1 Mass: 165
CD19 Santa Cruz SJ25C1 Mass: 163
CD21 Biolegend Bu32 Mass: 141
CD27 BD L128 Mass: 155
CD38 Fluidigm HIT2 Mass: 172
CD45 total Biolegend HI30 Mass: 89
CD45RA Biolegend HI100 Mass: 153
CD56 Miltenyi REA196 Mass: 168
CD66 BD B1.1/CD66 Mass: 113
CD86 Fluidigm IT2.2 Mass: 150
CD123 Fluidigm 6H6 Mass: 143
CD278/ICOS Biolegend C398.4A Mass: 156
CD179/PD1 Biolegend EH12.2H7 Mass: 162
IgD Biolegend IA6-2 Mass: 146
IgM Biolegend MHM-88 Mass: 151
CXCR5 BD RF8B2 Mass: 173
HLADR Biolegend L243 Mass: 167
Cytokines
IL-1α Biolegend 364-3B3-14 Mass: 147
IL-1β Biolegend  H1b-98 Mass: 169
IL-1RA Santa Cruz  AS17 Mass: 157
IL-6 Biolegend MQ2-13A5 Mass: 164
IL-8 BD E8N1 Mass: 160
IL-12/IL-23p40 Biolegend  C8.6 Mass: 171
IL-17A Biolegend  BL168 Mass: 148
IL23p19 eBioscience/Thermo 23dcdp Mass: 176
MIP1β BD D21-1351 Mass: 158
MCP1 BD 5D3-F7 Mass: 170
IFNα Miltenyi  LT27:295 Mass: 175
IFNγ Biolegend 4S.B3 Mass: 165
PTEN BD A2B1 Mass: 159
TNFα Biolegend Mab11 Mass: 166
Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling  Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. 

References

  1. Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
  2. Mak, A., Cheung, M. W. -. L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -. M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
  3. Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
  4. Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
  5. Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
  6. Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
  7. Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
  8. Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
  9. Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  10. Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
  12. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
  13. Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
  14. O’Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
  15. O’Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
  16. Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
  17. Amir, E. -. A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
  18. Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
  19. Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
  20. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
  21. Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
  22. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
  23. Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
  24. Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  25. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
  26. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
  27. Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
  28. Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).

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Baxter, R. M., Kong, D. S., Garcia-Perez, J. E., O’Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry. J. Vis. Exp. (136), e57780, doi:10.3791/57780 (2018).

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