Immunophenotype 및 Cytokine 생산 대량 Cytometry 통해 주변 전 혈의 단일 세포 분석
Summary
여기 우리 면역 phenotypic와 기능 (세포내 cytokine 유도)를 평가 하는 단일 셀 proteomic 접근 방식을 설명 주변 전체 혈액 샘플, 대량 cytometry 통해 분석으로 변경.
Abstract
Cytokines은 면역 질환의 병 인에서 중추적인 역할을 한다. 따라서, cytokine 레벨의 측정 self-tolerance 및 후속 면역의 붕괴에 지도 하는 정확한 메커니즘을 이해 하기 위해에서 여러 연구의 초점 되었습니다. 접근은 지금까지 단일 또는 몇 종류 (cytokines), 면역 체계의 특정 한 측면의 연구에 기초를 둔 하 고 복잡 한 자기 면역 질병의 세계적인 평가 제공 하지 않습니다. 환자 세라 기반 연구 자가 면역에 중요 한 통찰력 여유, 하는 동안 그들은 감지 dysregulated cytokines의 특정 세포 소스를 제공 하지 않습니다. Cytokine 생산 요인, 순환 하는 “본질적인” 환자 전용 플라즈마의 컨텍스트 내에서 여러 면역 세포 하위 집합에서 평가 하는 포괄적인 단일 셀 접근 방식은 여기에 설명 되어 있습니다. 이 방법은 환자 특정 면역 표현 형 (표면 마커)의 모니터링 가능 및 기능 (cytokines), 그것의 기본에서 “본질적인 병원 성” 질병 상태, 또는 치료제에비보 ( ex vivo)의 존재에.
Introduction
자가 면역 질환의 병 적 상태와 사망률 3-8%의 인구에 영향을 미치는 주요 원인입니다. 미국에서는, 자가 면역 질환에서는 젊은이 중 년 여성 사이에서 죽음의 주요 원인 중 (세 < 65 세)1,2. 자가 면역 질환 임상 유형이 다른 프레 젠 테이 션 및 다양 한 기본 면역 프로세스 특징입니다. 이 성분의 스펙트럼은 류 마티스 관절염 (RA) 공동 참여 및 다 발성 경화 증 (MS)에 신경 질환 등 다른 질환에서 잘 표현 된다. 그러나,이의이 수준은 또한 반성 루 푸 스 (SLE) 등 단일 장애 내 궁 행: 다른 혈액 또는 공동 참여3에서 고통을 하는 동안 일부 환자 신장 병 리, 현재 수 있습니다.
자가 면역 질환에 기본 immunopathogenesis 자동 및 하이퍼-활성화의 여러 하위 집합 타고 난 및 적응형 면역 세포, 및 부수적인 dysregulated cytokine 생산을 포함 하는 임상이 거울. Cytokines은 면역 질환의 병 인에서 중추적인 역할을, 하는 동안 질병의 기계 장치에 그들의 특정 역할을 이해 했다 입증 도전. Cytokines는 pleiotropy 특징 이다 (한 cytokine 다른 세포 유형에 여러 효과 가질 수 있습니다), 중복 (여러 cytokines 동일한 효과 가질 수 있습니다), 이중성 (한 cytokine 다른 조건 하에서 프로 또는 안티 inflammatory 효과 가질 수 있습니다), 고 소성 (cytokines에서 그것의 “원래”, 환경에 따라 서로 다른 역할에 주조 될 수 있다)4,,56. 따라서, 인구 수준 방법 다른 유형의 세포 응답 같은 “사이토카인 환경”을 구분할 수 없습니다. 마찬가지로, 연구 설계는 단일 셀 형식 (cytokine), 면역 체계의 특정 한 측면에 집중 하는 복잡 한 면역 질환에 관련 된 모든 요소에 대 한 글로벌 평가가 제공 하지 않습니다. 환자 세라 기반 연구 자가 면역에 중요 한 통찰력 여유, 하는 동안 그들은 감지 dysregulated cytokines의 특정 세포 소스를 제공 하지 않습니다.
최근에, 우리는 동시에 여러 개의 면역 세포 유형, 평가 하 고 환자 특정 “병원 성” 주변 혈액 플라스마 순환 요인의 주위에 그들의 다양 한 cytokine 물결을 감지 하는 단일 셀 proteomic 접근 방식을 개발. 여기에 설명 된 워크플로 고립 된 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 반대로 그대로 주변 전체 혈액 샘플의 사용에 의해 특징입니다. 주변 기기 전체 혈액 나타냅니다 조직의 면역 중재 질환, 자가 면역 질환 (즉, 중 성구, 혈소판), 및 2) 플라즈마 1) 비-단 혈 자주 참여를 포함 하 여 공부를 가장 순수 관련 차량을 면역 활성화 역할 있다 핵 산, 면역성이 있는 복합물, 및 cytokines, 등의 요소를 순환. 캡처하는 “본질적인 병원 성” dysregulated cytokine 생산, 주변 혈액 샘플 그리고 37의 ° C (생리 적 체온) 단백질 수송에서 외피의 6 h 혈액 무승부 (T0, 시간 제로), 후 즉시 처리 됩니다 cytokine 생산 (축적, T6 T0) “내장” 질병 상태 (그림 1)을 나타내는 것을 검출 하기 위하여 어떤 exogenous 자극 조건 (T6, 시간 6 h), 없을 경우에 억제 물. Dysregulated 프로세스에 반영 하는 신호 경로, 질병에 관련 된 면역 반응에 관련 된 주변 혈액 샘플은 아래의 활성화를 공부 하는 외 인으로 (단백질 수송 억제제와 37 ℃에서 6 h 외피) 치료 cytokine 생산 핵 산에 대 한 응답을 나타내는 것을 감지 하 질병 병 인, SLE (T6 + R848, 1 µ g/mL R848와 h 시간 6)의 경우 수신자 같은 수용 체 (TLR) 촉진제 등을 반영 하는 조건 자극 (T6 대 T6 T0 대 비교 + R848, 그림 1)입니다. 공부 하 고 사용할 수 있는 치료제 비보 전,의 immunomodulatory 효과 특정 환자에 대 한 정확한 면역 dysregulated 프로세스에 관련 된으로, 말 초 혈액 샘플은 JAK 억제제에는 관련 치료와 함께 처리 됩니다. 농도 (여기, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, 시간 6 h 5 uM ruxolitinib), 약물 (T6 대 T6 T0 대 + 5R, 그림 1)에 대 한 응답에서 “내장” 질병 상태에서 변화를 감지 하. JAK 억제제 JAK 저 해제 라스 같은 자가 면역 질환의 치료에 성공 하려면 표시 되었습니다 때문에이 연구에 대 한 선정
동시에 여러 면역 세포의 하위 집합, SLE에서 주변 혈액 샘플에서에서 설명한 dysregulated 프로세스를 평가 하기 위해 환자와 건강 한 컨트롤 위에서 설명한 대로 되었고 대량 cytometry 분석. 대량 cytometry, 일컬어 Cytometry 시간-의-비행, 스펙트럼의 문제7,,89오버랩 없이 단일 세포 분석의 40 개 이상의 매개 변수를 제공 합니다. 이 기술은 항 체, 대신 fluorophores10에 바인딩된 태그로 녹는 금속 이온의 형태에서 희토류 금속 동위 원소를 활용 합니다. 전화 외 에 맥 카시 외. (즉, 튜닝 및 교정, 샘플 수집) 대량 cytometry 기술 플랫폼에 관한 추가 정보를 찾을 수 있습니다. 11 , 12 대량 cytometry의 높은 차원 단일 셀 세분성 (자료 테이블) 타고 난 및 적응형 면역 세포 하위 집합에 걸쳐 여러 cytokines의 동시 측정을 수 있습니다.
현재 기존의 임상 및 실험실 매개 변수는 종종 나 지속적인 질병 활동 또는 특정 immunomodulators13, 더 나은 기본 면역 윤곽을 그리 다 하는 필요를 반영에 대 한 응답을 탐지 하기 위한 구체적 플레어 드라이브를 변경 합니다. 항 체 또는 작은 분자 억제제 cytokines를 대상으로 또는 단백질 cytokine 생산의 규칙에 관련 된 신호를 사용 하는 치료 접근의 과다는 면역 질환에서 cytokine dysregulation의 보급을 감안할 때, 최근 나왔다. 기본 형식, 여기에 설명 된 주변 혈액 분석 접근 환자 전용 dysregulated 셀 하위 집합 및 그들의 비정상적인 cytokine 생산 조직 발현과 자가 면역 질환에 식별 하기 위해 플랫폼을 제공 합니다. 이 방법을 특정 dysregulated cytokines를 확인할 수 있습니다, 그리고 구체적인 치료 옵션 수 테스트 ex vivo immunomodulate에 그들의 능력을 평가 하기 위해 환자 특정 질병 치료 선택의 개인 설정에 대 한 허용 프로세스입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 소설, 단일 셀, proteomic 접근 방식은 동시에 여러 면역 세포 유형을 평가 하 고 환자 특정 “병원 성” 주변 혈액 플라스마 순환 요인의 주위에 그들의 다양 한 cytokine 물결을 감지 하 여 설명 합니다. 이 방법은 분석 차량과 면역 세포 phenotypic와 기능 이상의 평가 위한 도구로 대량 cytometry로 주변 전 혈을 사용합니다. 메서드는 인간과 쥐 연구21, 쉽게 적용 하 고 다른 면역 기능 분…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그녀의 지적 입력 및 도움이 의견에 대 한 아미 Pugh-버나드를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 Boettcher 재단 웹 Waring 생명 의학 연구 상 및 수상 수 K23 1K23AR070897는 NIH에서 엘레나 W.Y. 셰에 의해 지원 되었다. 그녀는 또한 어린이 건강, 스탠포드 CTSA UL1 TR001085, 및 아동 건강 연구를 위한 아동 건강 및 인간 개발 및 루 패 커드 재단의 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소에서 보너스 번호 K12-HD000850에 의해 지원 되었다 연구소의 스탠포드 대학입니다.
Materials
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
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