Assemblage rapide, évolutive et dans divers Nanocarriers synthétique Via Flash nanoprécipitation apport de protéines bioactives et Immunostimulants
Summary
Nanomatériaux fournit des mécanismes polyvalents des livraisons surveillées de thérapeutiques pour les sciences fondamentales et applications translationnelles, mais souvent, leur fabrication nécessite une expertise qui n’est pas disponible dans les laboratoires biomédicaux plus. Nous présentons ici les protocoles pour la fabrication évolutive et thérapeutique chargement de divers nanocarriers auto-assemblés en utilisant flash nanoprécipitation.
Abstract
Nanomatériaux présente un large éventail d’options pour personnaliser l’administration CONTROLEE de charges moléculaires simples et combinés pour des applications thérapeutiques et d’imagerie. Cette spécificité accrue peut avoir des implications cliniques importantes, y compris une diminution des effets secondaires et les doses inférieures avec la plus grande puissance. En outre, le in situ ciblant modulation contrôlée des sous-ensembles spécifiques de cellules peut améliorer les études in vitro et in vivo des phénomènes biologiques fondamentaux et sonder la fonction des cellules. Malheureusement, les compétences requises en nanoscale science, chimie et génie souvent interdire sans expérience dans ces domaines, les laboratoires de fabrication et la personnalisation des nanomatériaux comme outils pour leurs recherches ou de véhicules pour leur stratégies thérapeutiques. Ici, nous fournissons des protocoles pour la synthèse et l’Assemblée évolutive d’un système de copolymère polyvalent non-toxiques bloc se prêtent à la formation facile et chargement des véhicules nanométriques pour applications biomédicales. Flash nanoprécipitation est présentée comme une méthodologie pour la fabrication rapide de diverses nanocarriers de poly(ethylene glycol) –bl-copolymères poly (sulfure de propylène). Ces protocoles permettra de laboratoires avec un large éventail d’expertise et de ressources à facilement et reproductible fabriquer nanocarrier avancée vecteurs pour leurs applications. Processus de conception et construction d’un instrument automatisé qui utilise une pompe à seringue à grande vitesse pour faciliter la nanoprécipitation flash et pour permettre un contrôle amélioré sur l’homogénéité, la taille, la morphologie et le chargement de nanocarriers de polymersome est décrit.
Introduction
Nanocarriers permettant la livraison surveillée du fret petit et macromoléculaire, entités actives y comprises qui, si non encapsulés, serait soit hautement dégradable et/ou trop hydrophobe pour l’administration in vivo. Des morphologies nanocarrier régulièrement fabriqués, vésicules polymériques analogues aux liposomes (également appelés polymersomes) offrent la possibilité de charger simultanément cargaison hydrophile et hydrophobe1,2. Malgré leurs avantages prometteurs, polymersomes sont encore rares dans les applications cliniques, en partie, à plusieurs grands défis dans leur fabrication. Pour l’usage clinique, des formulations de polymersome il faut faire par lots à grande échelle, stériles et cohérentes.
Un certain nombre de techniques peut être utilisé pour la forme polymersomes d’un copolymère à deux blocs, tels que poly(ethylene glycol) –bloc-poly (sulfure de propylène) (PEG –bl– PPS), qui incluent des solvants dispersion3, film mince réhydratation1 , 4, microfluidique 5,6et hydratation direct7. Dispersion de solvant implique fois longue incubation en présence de solvants organiques, ce qui peuvent dénaturer certaines charges bioactifs, comme les protéines. Réhydratation minces n’offre pas de contrôle sur la polydispersité de le polymersomes formé, nécessitant souvent des techniques d’extrusion et coûteux pour atteindre monodispersion acceptable. En outre, tant microfluidique et hydratation directe sont difficiles à échelle pour les plus gros volumes de production. Les méthodes de fabrication différentes nanocarrier, flash nanoprécipitation (FNP) offre la possibilité de faire des formulations à grande échelle et reproductibles8,9,10. Alors que les FNP était précédemment réservé pour la formulation des nanoparticules de base solide, notre laboratoire a récemment élargi l’utilisation des FNP d’inclure la formation uniforme de divers PEG –bl– PPS nanostructure morphologies11, 12, dont polymersomes11 et bicontinues nanosphères12. Nous avons constaté que FNP était capable de former des formulations monodisperses de polymersomes sans la nécessité pour l’extrusion, ayant pour résultat les valeurs d’index de polydispersité supérieure par rapport aux non extrudé polymersomes formé par dispersion de réhydratation et solvant de film mince 11. bicontinues nanosphères, avec leurs vastes domaines hydrophobes, n’ont pas pu être formé par réhydratation minces, malgré la formation sous certaines conditions de solvants avec FNP12.
Ici, nous fournir une description détaillée pour la synthèse de la PEG – copolymère à deux blocsbl– PPS utilisé dans la formation de polymersome, le batteur de jets (CIJ) impingement confiné utilisé pour les FNP, le FNP Protocole lui-même et la mise en œuvre d’un système automatisé de réduire la variabilité de l’utilisateur. Informations sur la façon de stériliser le système suffisamment pour produire des formulations exemptes d’endotoxines pour utilisation in vivoet les données représentatives concernant la caractérisation des polymersomes formé par les FNP est inclus. Avec cette information, les lecteurs avec intérêt en utilisant polymersomes pour travaux in vitro et in vivo seront en mesure de fabriquer leurs propres formulations monodispersés stérile. Lecteurs ayant une expérience dans les formulations de nanocarrier et avec l’expertise de la synthèse de polymère sera en mesure de rapidement tester leurs propres systèmes de polymère utilisant des FNP comme une alternative possible à leurs techniques de formulation actuelle. En outre, les protocoles décrits dans les présentes peuvent servir comme outils pédagogiques pour la formulation de nanocarriers en cours de laboratoire de nanotechnologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous fournissons des instructions détaillées pour la fabrication rapide de polymersomes à l’aide de PEG17–bl– PPS35-SH comme le copolymère à deux blocs. Polymersomes vésiculaires sont la morphologie globale primaire Assemblée à ce ratio PEG hydrophile et hydrophobes PPS bloc de poids moléculaire. Lorsque empiété plusieurs fois, ils ont un diamètre et polydispersité qui correspond polymersomes extrudée à travers une membrane nm 200 après avoir été formé par hydr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons que le personnel et instrumentation prennent en charge de l’installation de biologie structurale à la Northwestern University. Le soutien de la R.H. Lurie complète Cancer Center de l’Université Northwestern et les installations de biologie structurelle Northwestern University est reconnu. Le détecteur d’électrons direct Gatan K2 a été acheté avec des fonds fournis par le Consortium de recherche biomédicale de Chicago avec l’appui des fonds Searle à The Chicago Community Trust. Nous remercions également les équipements suivants à la Northwestern University : l’installation interdisciplinaire des sciences Surface Keck, l’installation de biologie structurale, l’installation d’imagerie biologique, du Center for Advanced Molecular Imaging et l’analytique Bionanotechnologie équipement Core. Cette recherche a été financée par la subvention de la Fondation nationale des sciences 1453576, instituts nationaux de santé directeur New Innovator Award 1DP2HL132390-01, le Center for Regenerative nanomédecine Catalyst Award et le prix de catalyseur de McCormick de 2014. SDA a été en partie soutenue par les NIH pré-doctoral biotechnologie formation Grant T32GM008449.
Materials
| CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit – 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
| Linear Bearing Platform (Small) – 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
| Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
| Linear Rail Shaft Guide/Support – 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
| Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
| MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
| Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
| PicoBorg Reverse – Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
| Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
| Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
| Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
| Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
| Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
| N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
| Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
| Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
| Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
| Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
| Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
| Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
| Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
| Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
| Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| 1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
| Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
| Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
| CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
| HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
| RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |
References
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