Montagem rápida, escalável e carregamento de proteínas bioativas e Imunoestimuladores em diversas Nanocarriers sintéticas através de Flash Nanoprecipitation
Summary
Nanomateriais fornecem mecanismos versátil de entrega terapêutico controlado para tanto a ciência básica e aplicações de translação, mas sua fabricação muitas vezes requer perícia que não está disponível em laboratórios mais biomédicos. Aqui, apresentamos os protocolos para a fabricação escalável e carregamento terapêutico de diversas nanocarriers Self montado usando flash nanoprecipitation.
Abstract
Nanomateriais apresentam uma ampla gama de opções para personalizar a entrega controlada de cargas moleculares simples e combinadas para aplicações terapêuticas e de imagem. Esta especificidade aumentada pode ter importantes implicações clínicas, incluindo diminuição de efeitos colaterais e doses mais baixas, com maior potência. Além disso, o em situ direcionamento controlada modulação de subconjuntos de célula específica pode melhorar investigações in vitro e em vivo dos fenômenos biológicos básicos e sonda função CÉL. Infelizmente, a experiência necessária em nanoescala ciência, química e engenharia muitas vezes proibir laboratórios sem experiência nestas áreas de fabricação e personalização de nanomateriais como instrumentos para suas investigações ou veículos para seus estratégias terapêuticas. Aqui, nós fornecemos os protocolos para a síntese e escalável montagem de um sistema de copolímero versátil tóxicos bloco favorável à formação facile e carregamento dos veículos de nanoescala para aplicações biomédicas. Nanoprecipitation flash é apresentado como uma metodologia para fabricação rápida de diversas nanocarriers de poly(ethylene glycol) –bl-copolímeros de poli (sulfeto de propileno). Estes protocolos permitirá laboratórios com uma vasta gama de conhecimentos e recursos para facilmente e fabricar reproducibly nanocarreador avançados sistemas de entrega para suas aplicações. Processam de concepção e construção de um instrumento automatizado que emprega uma bomba de seringa de alta velocidade para facilitar o nanoprecipitation flash e para permitir maior controle sobre a homogeneidade, tamanho, morfologia e carregamento de polymersome nanocarriers é descrito.
Introduction
Nanocarriers permitir a entrega controlada de carga pequena e macromolecular, incluindo entidades activas que, se não encapsulado, seria altamente degradável ou muito hidrofóbico para administração na vivo. Das morfologias nanocarreador regularmente fabricadas, poliméricas vesículas análogas aos lipossomas (também chamados polymersomes) oferecem a capacidade de carregar simultaneamente hidrofílico e hidrofóbico carga1,2. Apesar de suas vantagens promissoras, polymersomes ainda são raros em aplicações clínicas devido, em parte, para vários desafios-chave em sua fabricação. Para uso clínico, formulações de polymersome precisam ser feitas em lotes em grande escala, estéril e consistentes.
Um número de técnicas pode ser usado para polymersomes forma de um copolímero de diblock, como poly(ethylene glycol) –bloco-poli (sulfeto de propileno) (PEG –bl– PPS), que incluem a dispersão solvente3, película fina reidratação1 , 4, microfluídica 5,6e hidratação direta7. Dispersão de solvente envolve tempos de incubação longa na presença de solventes orgânicos, que podem desnaturar algumas cargas bioativas, como proteínas. Reidratação de película fina não oferece controle sobre a polidispersividade do polymersomes formado, muitas vezes exigindo técnicas de extrusão caro e demorado para conseguir monodispersity aceitável. Além disso, ambos microfluids e hidratação direta são difíceis de escala para maiores volumes de produção. O nanocarreador diferentes métodos de fabricação, flash nanoprecipitation (FNP) oferece a capacidade de fazer em grande escala e reprodutíveis formulações8,9,10. Enquanto FNP foi anteriormente reservado para a formulação de nanopartículas de núcleo sólido, nosso laboratório recentemente expandiu o uso da FNP para incluir a formação consistente de diversas PEG –bl– PPS nanostructure morfologias11, 12, incluindo polymersomes11 e bicontinuous nanoesferas12. Descobrimos que a FNP foi capaz de formar monodisperso formulações de polymersomes sem a necessidade de extrusão, resultando em valores de índice de polidispersividade superior em comparação com não-extrudados polymersomes formada pela dispersão de reidratação e solvente de película fina 11. Bicontinuous nanoesferas, com seus grandes domínios hidrofóbicos, não foram capazes de ser formado por reidratação de película fina, apesar de formando sob várias condições de solventes com FNP12.
Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada para a síntese do PEG – copolímero de diblock – PPSblusada na formação de polymersome, o misturador de jatos (CIJ) do choque confinados usado para FNP, a FNP do protocolo em si e a implementação de um sistema automatizado para Reduza a variabilidade do usuário. Informações sobre como esterilizar o sistema suficiente para produzir formulações endotoxina-livre para uso na vivoe dados representativos sobre a caracterização de polymersomes formado pela FNP está incluído. Com esta informação, os leitores com interesse em utilizar polymersomes para in vitro e in vivo de trabalho será capazes de fabricar suas próprias formulações monodisperso estéril. Leitores com experiência em formulações nanocarreador e com expertise de síntese de polímero será capazes de testar rapidamente seus próprios sistemas de polímero usando FNP como uma alternativa potencial para suas técnicas de formulação atual. Além disso, os protocolos descritos neste documento podem ser usados como ferramentas educacionais para a formulação de nanocarriers nos cursos do laboratório de nanotecnologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós fornecemos instruções detalhadas para a preparação rápida de polymersomes usando PEG17–bl– PPS35-SH como o copolímero de diblock. Polymersomes vesiculares são a morfologia de agregação primária montada para esta relação de PEG hidrofílica e hidrofóbico PPS bloco molecular peso. Quando invadiam várias vezes, eles têm um diâmetro e polidispersividade que corresponde a polymersomes extrudados através de uma membrana de nm 200 depois de ter sido formada através de</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos que o suporte pessoal e instrumentação da instalação de biologia estrutural da Universidade de Northwestern. Reconhece-se o apoio da R.H. Lurie abrangente Cancer Center da Universidade do noroeste e as instalações de biologia estrutural Universidade Northwestern. O detector de elétrons direto Pauo K2 foi comprado com fundos fornecidos pelo consórcio biomédica de Chicago com o apoio dos fundos Searle em Chicago comunidade Trust. Agradecemos também as seguintes facilidades da Northwestern University: Centro Interdisciplinar de ciência superfície de Keck, o instrumento de biologia estrutural, a facilidade de imagem biológica, o centro de imagem Molecular Avançada e a analítica Núcleo de equipamentos bio-nanotecnologia. Esta pesquisa foi apoiada pela concessão do National Science Foundation do 1453576, os institutos nacionais de saúde diretor novo prêmio inovador 1DP2HL132390-01, o centro de regenerativa nanomedicina Catalyst Award e o prêmio de catalisador de McCormick de 2014. SDA foi apoiada em parte pelo NIH predoctoral biotecnologia formação Grant T32GM008449.
Materials
| CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit – 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
| Linear Bearing Platform (Small) – 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
| Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
| Linear Rail Shaft Guide/Support – 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
| Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
| MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
| Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
| PicoBorg Reverse – Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
| Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
| Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
| Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
| Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
| Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
| N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
| Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
| Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
| Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
| Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
| Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
| Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
| Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
| Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
| Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| 1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
| Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
| Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
| CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
| HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
| RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |
References
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