快速, 可伸缩的组装和负载的生物活性蛋白和免疫增强剂到不同的合成 Nanocarriers 通过闪光 Nanoprecipitation
Summary
纳米材料为基础科学和平移应用提供了可控制的治疗付的多种机制 , 但它们的制造往往需要在大多数生物医学实验室中不可用的专业知识。在这里, 我们提出了可伸缩的制造和治疗负载的各种自组装 nanocarriers 使用闪光 nanoprecipitation 的协议。
Abstract
纳米材料提供了多种选择, 用于自定义用于治疗和成像应用的单一和组合分子有效载荷的控制交付。这种增加的特异性可能具有重要的临床意义, 包括减少副作用和较低剂量的功效。此外, 对特定细胞亚群的原位靶向和控制调制可以提高体外和体内对基本生物学现象和探针细胞功能的研究。不幸的是, 在纳米科学、化学和工程方面所需的专门知识往往禁止在这些领域没有经验的实验室从制造和定制纳米材料作为其调查或车辆的工具, 以供其治疗策略。在这里, 我们提供了合成和可伸缩组装的协议, 一个多功能的无毒嵌段共聚物系统, 适于简便地形成和加载纳米车辆的生物医学应用。闪光 nanoprecipitation 是一种快速制造多种 nanocarriers 的方法, 从聚乙二醇-bl-聚丙烯 (丙烯硫化物) 共聚物。这些协议将允许实验室具有广泛的专业知识和资源, 方便和重现性制造先进的 nanocarrier 交付系统的应用。设计和建造一个自动化的仪器, 使用高速注射器泵, 以促进闪光 nanoprecipitation 过程, 并允许加强控制的均匀性, 大小, 形态和负载的 polymersome nanocarriers 是描述。
Introduction
Nanocarriers 允许控制交付小和大分子货物, 包括活跃实体, 如果不封装, 将是高度降解和/或太疏水性, 以管理在体内。nanocarrier 的形态通常是捏造的, 类似于脂质体 (也称为 polymersomes) 的聚合物泡, 提供了同时负载亲水性和疏水货物1,2的能力。尽管他们有很好的优势, 但 polymersomes 在临床应用方面仍不多见, 部分原因是他们的制造业面临一些关键挑战。对于临床使用, polymersome 配方需要在大规模, 不育, 和一致的批次。
一些技术可以用来形成 polymersomes 从两嵌段共聚物, 如聚乙二醇-聚 (丙烯硫化物) (PEG-苯硫醚), 包括溶剂分散3,薄膜补液1,4, 微流体5,6, 直接水化7。溶剂分散在有机溶剂的存在下需要长时间的潜伏期, 这可能变性一些生物活性有效载荷, 如蛋白质。薄膜补液不提供对形成的 polymersomes 的多分散性的控制, 通常需要昂贵和耗时的挤出技术, 以达到可接受的单分散性。此外, 微流体和直接水化都很难扩大到较大的生产量。在不同的 nanocarrier 制造方法中, 闪光 nanoprecipitation (FNP) 提供了大规模和可再生配方8,9,10的能力。虽然 FNP 以前是为制备固体核纳米粒子而预留的, 但我们的实验室最近扩大了 FNP 的使用范围, 包括了各种不同的 PEG-苯硫醚纳米结构形貌的一致形成11, 12, 包括 polymersomes11和 bicontinuous 球12。我们发现, FNP 是能够形成单分散配方的 polymersomes 不需要挤出, 导致优越的多分散性指数值与非挤压 polymersomes 形成的薄膜补液和溶剂分散11. 尽管在许多溶剂条件下形成了 FNP12, 但 Bicontinuous 球的大疏水域却无法通过薄膜补液形成。
在这里, 我们提供了一个详细的描述, 以合成的 PEG-bl-PPS 两嵌段共聚物用于 polymersome 的形成, 密闭撞击射流 (CIJ) 混合器用于 FNP, FNP 协议本身, 并实施一个自动化系统, 以减少用户的可变性。包括关于如何充分消毒系统以产生体内使用的无内毒素制剂的信息, 以及关于 FNP 形成的 polymersomes 的代表性数据。有了这些信息, 有兴趣的读者在体外和体内工作中使用 polymersomes 将能够制造出他们自己的无菌, 单分散配方。具有 nanocarrier 配方和高分子合成专业知识经验的读者将能够使用 FNP 作为现有配方技术的潜在替代品, 快速测试自己的聚合物系统。此外, 本文所描述的协议可作为 nanocarriers 在纳米技术实验室课程中的应用的教育工具。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们提供了详细的指示, 以快速制造 polymersomes 使用 PEG17–bl-PPS35-SH 作为两嵌段共聚物。水泡 polymersomes 是在亲水性 PEG 和疏水性 PPS 块分子量的比值下组装的主要骨料形态。当撞击多次, 他们有一个直径和多分散性匹配 polymersomes 挤出通过200纳米膜后,通过薄膜水化形成。因此, 该协议消除了在制造单分散 polymersome nanocarriers 过程中需要额外的挤出步骤。Polymersomes 通过 <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们承认西北大学结构生物学设施的工作人员和仪器支持。右侧西北大学综合癌症中心和西北大学结构生物学设施的支持。加坦 K2 直接电子探测器购买了由芝加哥生物医学财团提供的资金在芝加哥社区信托基金的支持。我们还感谢西北大学的下列设施: 凯克跨学科表面科学设施、结构生物学设施、生物成像设施、高级分子成像中心和分析Bionanotechnology 设备核心。这项研究得到1453576国家科学基金会资助, 国家卫生研究院主任的新创新奖 1DP2HL132390-01, 再生纳米医学催化剂奖和2014麦考克催化剂奖的中心。全国卫生研究院 predoctoral 生物技术培训补助金 T32GM008449 部分支助了该基金。
Materials
| CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit – 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
| Linear Bearing Platform (Small) – 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
| Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
| Linear Rail Shaft Guide/Support – 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
| Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
| MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
| Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
| PicoBorg Reverse – Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
| Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
| Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
| Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
| Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
| Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
| N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
| Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
| Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
| Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
| Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
| Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
| Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
| Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
| Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
| Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| 1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
| Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
| Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
| CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
| HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
| RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |
References
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