חקר את הפוטנציאל של תא גזע Mesenchymal גיליון על הפיתוח של קרצינומה Hepatocellular In Vivo
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפתח ויוו סרטן מודל של שימוש בטכנולוגיית תאי גליון. מודל כזה יכול להיות מאוד שימושי עבור הערכת הרפוי נגד סרטן.
Abstract
אין ויוו במודל חיה המחקה סרטן אנושי יכול להיות יישומים שונים המספקים מידע קליני משמעותי. משמש כיום הטכניקות לפיתוח ויוו סרטן דגמים יש מגבלות ניכר. לפיכך, במחקר זה, אנו שואפים לממש בטכנולוגיית תאי גליון לפתח מודל סרטן ויוו . קרצינומה Hepatocellular (HCC) מפותחת בהצלחה בחולדות עירום באמצעות גליונות התא שנוצר מתאי השורה תא HCC. הסדינים התא סרטן שנוצרו באמצעות אדהזיה תאיים ויצירת מבנה מרובדת, נשלט על ידי מטריצות. דבר זה מאפשר השתלת גיליון HCC לתוך הכבד ויצירת מודל בעלי חיים נושאות תוך חודש. בנוסף, חקר את התפקיד של גזע mesenchymal (MSC) בפיתוח של מודל זה סרטן. בנוסף הגיליון קו תא HCC, נוצרים עוד תא שני גיליונות: גיליון HCC תאי מח עצם MSCs (BMMSCs) ואת גיליון של תאים HCC, חבל הטבור MSCs (UCMSCs). הגליונות אשר יש שילוב של תאים HCC והן MSCs הם גם מסוגלים לייצר חיה נושאות. עם זאת, התוספת של MSCs מקטין את גודל הגידול בנוי, זו השפעה שלילית על התפתחות גידולים משתנה בהתאם למקור של MSCs בשימוש. אפשרות זו מציינת כי גיליון תא העשוי מסוימת יחוברו MSC יכול להיות מנוצל שליטה וניהול של הגידול.
Introduction
HCC הוא סרטן ראשוני של הכבד, קשורה באופן משמעותי עם פרוגנוזה גרועה. מדי שנה, כמעט חצי מיליון חולים חדשים מאובחנים עם HCC, המייצג 85% של סרטן הכבד בחולים ברחבי העולם1. Hepatocarcinogenesis אינה מחלה אחת-טופס; ליתר דיוק, זה אוסף של מחלות בעלי תכונות שונות histopathological ולשינויים גנטיים ולא גנומית, בנוסף מגוון תוצאות prognostic1. לכן, האתגרים העיקריים בהתפתחות של אסטרטגיית טיפולית יעילה עבור HCC הן את הידע מוגבל לביולוגיה HCC וחוסר מודל ניסיוני מתאימים בעלי חיים שיכולים לעזור להבין זו מחלה מורכבת. אין ויוו במודל חיה המחקה סרטן אנושי הוא הכרחי עבור בחירת המועמד גנים וזיהוי סמנים prognostic/ניבוי ערבו אינדוקציה סרטן, כמו גם על חקירת גורמים שונים שעשויים להשפיע על סרטן תגובות לסוכנים טיפולית.
מחקרים במבחנה סרטן משויכות עדיין מגבלות הגדולות. זה בשל העובדה כי התאים הסרטניים לאבד תכונות רבות שלהם ויוו כאשר נשמר בתרבות. השינויים שמתרחשים תאי במבחנה תוצאה של העדר רקמות כל הפיזיולוגיה באווירה ex-vivo . סרטן-לתא אינטראקציה (סטרומה, המערכת החיסונית, להערכת, אפיתל, וכו ‘) בתוך microenvironment הגידול משקף במידה רבה על סרטן התא מאפיינים2. Microenvironment הגידול יכול לשנות ביטוי גנים/חלבון התא סרטן ומאפיינים פנוטיפי, בנוסף angiogenetic ואת פוטנציאל גרורתי. מערכת התרבות דו-ממדית (2-D) במבחנה חסרה גם מטריצה רקמות מתאים, אשר הכרחי לווסת את התקדמות הגידול. לפיכך, בשל מגבלות אלו, מודלים ויוו צריך תמיד להיות מנוצל כדי לתמוך ממצאים ראשוניים של מודלים במבחנה . במחקר זה, אנו משתמשים בטכנולוגיית תאי גליון לפתח ויוו במודל חיה זה elucidates את התהליך הביולוגי המלא שבבסיס HCC.
לפני יותר מעשור מעבדה של Okano הוקמה שיטה של הנדסת רקמות, המבוסס על טכנולוגיית תא גליון3. שיטה זו משתמשת פלסטיק תרבות מגיבים תרמו כדי לאפשר הפיכה תא אדהזיה/ניתוק על ידי שליטה על פני השטח hydrophobicity. שיטה זו מאפשרת קציר עדין של תאים בתרבית בתבנית ללא פגע תלת-ממדיים (3-D) (גיליון i.e.,cell), עם מטריצה חוץ-תאית מטופחים (ECM) ואינטראקציות מתא לתא. הטכניקה גיליון תא מחייב את precoating של תרבות מנות עם poly(N-isopropylacrylamide) טמפרטורה-מגיבה פולימר (אני פיפה), וזו מסחרית זמינים ומוכנים לשימוש. בטמפרטורה מתחת 20 ° C, פולימרים פיפה אני להפוך להתייבש, להמיס פתרונות מימית, ואילו, בטמפרטורה גבוהה (37 מעלות צלזיוס), פולימרים להתייבש, להפוך התמיסה עכורים. הפולימר מכיל אמיד הידרופילית שרשראות הידרופוביות לצד רשתות (איזופרופיל קבוצות). בטמפרטורות גבוהות, תנועה בראונית של מולקולות מים מתעצמת, הואיל בטמפרטורה נמוכה, מולקולות המים המקיפים את קבוצות איזופרופיל של פירוק מבנה רטוב וקבוצות איזופרופיל הידרופובי צבירה בגלל אינטראקציות הידרופוביות. לכן, כל שרשרת הפולימר אגרגטים, ארגונייט שוקע4.
במסגרת המחקר הציג, בטכניקה זו משתמשים לפתח מודל חיה HCC באמצעות שלושה גליונות תאים שונים. הגיליון הראשון מועסקים מורכב HCC תא שורת תאים בלבד, בעוד ששני הדפים האחרים מורכבים של שילוב של HCC תא שורת תאים MSCs משני מקורות שונים: MSCs במח העצם (BMMSCs) ו- MSCs הטבור (UCMSCs). MSCs הם הלא-hematopoietic סטרומה תאים המסוגלים המבדילים intocell נגזרות של השושלת mesenchymal, כולל adipocytes, osteocytes, chondrocytes ונייטרלים5. הסיבה שאנו מעסיקים תאים אלה בעת יצירת גליון התא סרטן היא תפוקתב לא עקבית על ההשפעה של MSCs על סרטן. הוצע כי MSCs יכולים להיות שני פנוטיפים שונים: “MSC1”, הפנוטיפ proinflammatory, ו- “MSC2”, פנוטיפ לדיכוי המערכת החיסונית6. MSCs מבטאים קולטנים כמו אגרה (TLRs). TLR4 לקרקע של MSCs מגביר את הפרשת גורמים proinflammatory, ואילו לקרקע TLR3 מגביר את הפרשת גורמים לדיכוי המערכת החיסונית6. המחקר במבחנה של פנוטיפים שני אלה דיווחו כי תרבות משותפת של MSC1 עם שורות תאים סרטן הקלוש צמיחת תאים של סרטן, בעוד תרבות משותפת MSC2 היה את האפקט ההפוך7. זה מרמז כי MSCs יכול להיות סרטן בעד או נגד סרטן, בהתאם פנוטיפ שלהם. לכן, בנוסף פיתוח המודל בעלי חיים HCC בטכנולוגיה גיליון תא, אנחנו רוצים לחקור את ההשפעה של השתלות MSC על התפתחות גידולים, ואם באמצעות תאים אלה להגביר או להפחית את התפתחות מודל זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמות נרחבת של המחקר מוקדש להתפתחות נאותה ויוו פרה במודל חיה הדומה סרטן אנושיים. כיום, הגישות העיקריים המשמשים ליצירת מודלים בעלי חיים סרטן כרוך השתלת הנדסה גנטית ותא11. מודלים מהונדס גנטית הם כלים טובים עבור זיהוי ואימות של גנים היעד, כמו גם להבין את המנגנונים המולקולריים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות הצוות של ניתוח ניסיוני, חיות מעבדה המכללה לרפואה, אוניברסיטת המלך סעוד, שיתוף פעולה, תמיכה-במיוחד Almukhayzim חוסיין, הישאם Aloudah. המחברים גם רוצה להכיר את הצוות המדיה באוניברסיטת המלך סעוד סל ישראל אריאל להכנת חזותית את החומר-במיוחד Muath סל ר’נאם, רעות קרן אלינוי קסוטו.
Materials
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river | ||
References
- Marra, M., et al. Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview. Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Kushida, A., et al. Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide). Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), e10088 (2010).
- Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis. PLoS One. 7 (9), e45590 (2012).
- Curtin, L. I., et al. Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats. Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).
- . Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats – ULAM Guidelines and SOPs – Michigan Medicine Confluence Available from: https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats (2017)
- Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models. PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).
- Russo, J., Russo, I. H. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).
- Driscoll, J. S. The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute. Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).
- Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering. Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).
- Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).
- Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. Cell sheet transplantation for heart tissue repair. Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).
- Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology. International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?. Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).
