Здесь мы представляем протокола разработать в vivo рака модели с помощью технологии cell листа. Такая модель может быть очень полезным для оценки противоопухолевой терапии.
В естественных условиях животных модель, которая имитирует человека рак может иметь различные приложения, которые обеспечивают значительные клинической информации. В настоящее время используемые методы для разработки моделей в vivo рака имеют значительные ограничения. Таким образом в этом исследовании, мы стремимся реализовать ячейку листа технологии для разработки модели рака в естественных условиях . Гепатоцеллюлярной карциномой (HCC) успешно развивается в обнаженной крыс с использованием клеток листы, созданные из КЦУК клеток линии клеток. Раковых клеток листы создаются через внутриклеточные адгезии и формирование стратифицированной структуры, контролируемых внеклеточного матрикса. Это позволяет для трансплантации лист КЦУК в печень и создание модели животных опухоль подшипник в течение месяца. Кроме того исследуется роль мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в развитии этой рака модели. Помимо КЦУК ячейки строки листа, создаются еще две ячейки листов: лист КЦУК клеток и костного MSCs (BMMSCs) и лист КЦУК клеток и пуповины MSCs (UCMSCs). Листы, которые имеют сочетание КЦУК клеток и MSCs способны также производить опухоль подшипник животных. Однако добавление MSCs уменьшает размер сформированных опухоли, и это неблагоприятное воздействие на развитие опухоли варьируется в зависимости от источника используется MSCs. Это указывает, что ячейки листа, из некоторых MSC подтипы могут быть использованы в опухоли и управления.
КЦУК является Первичный рак печени, существенно связано с плохим прогнозом. Ежегодно почти полумиллиона новых пациентов с диагнозом КЦУК, составляет 85% от рака печени пациентов во всем мире1. Hepatocarcinogenesis является не одной формы заболевания; скорее это набор болезней, которые имеют различные Гистопатологические особенности и генетический и геномный изменчивости, в дополнение к разнообразны прогнозные результаты1. Таким образом основные проблемы в развитии эффективной терапевтической стратегии для КЦУК являются ограниченные знания биологии КЦУК и отсутствие подходящих экспериментальных животных модель, которая может помочь понять этого сложного заболевания. В естественных условиях животных модель, которая имитирует человека рак необходим для выбора кандидата генов и выявления прогностических/прогнозирования маркеры, замешанных в индукции рака, а также для расследования различных факторов, которые могут влиять на рак ответы для терапевтических агентов.
В vitro исследования рак по-прежнему связаны с основными ограничениями. Это связано с тем, что раковые клетки теряют многие из их в vivo особенности когда поддерживается в культуре. Изменения, которые происходят в ячейках в витро результат из-за отсутствия всей ткани физиологии в обстановке ex vivo . Рака в ячейке взаимодействия (стромы, иммунной, сосудистую, эпителиальных и т.д.) в пределах микроокружения опухоли сильно отражается на раковых клеток характеристики2. Микроокружения опухоли могут изменить выражение гена/белков клеток рака и фенотипические характеристики, в дополнение к angiogenetic и метастатическим потенциалом. Двумерные (2-D) в vitro культуры система также не имеет матрицу подходящей ткани, которая необходима для регулирования прогрессии опухоли. Таким образом из-за этих ограничений, в естественных условиях модели, всегда должны использоваться для поддержки предварительные выводы в vitro моделей. В этом исследовании мы используем ячейки листа технологии для разработки в vivo животной модели, разъясняет полное биологический процесс лежащие в основе КЦУК.
Более чем десятилетие назад, создана лаборатория Окано новый метод тканевой инженерии, основанный на ячейку листа технологии3. Этот метод использует термо отзывчивым культуры пластика позволяют реверсивные клеток адгезии/отряд, контролируя гидрофобность поверхности. Этот метод позволяет нежный уборки культивируемых клеток в нетронутыми трехмерной (3-D) формате (i.e.,cell листа), с ухоженными внеклеточного матрикса (ECM) и ячеек для взаимодействия. Ячейки листа техника требует намывного культуры блюд с температуры отзывчивым полимера poly(N-isopropylacrylamide) (PIPA Am), который является коммерчески доступны и готовы к использованию. При температуре ниже 20 ° C Пипа Am полимеров стать гидратированных и растворить в водных растворах, в то время как при более высокой температуре (37 ° C), полимеры становятся обезвоженной и превратить в мутным осадком. Полимер содержит гидрофильные Амида цепи и гидрофобных боковых цепей (изопропиловый группы). При высоких температурах броуновское движение молекул воды усиливается, в то время как при низкой температуре, агрегировать молекул воды, окружающие изопропиловый групп гидратированных структура разбивки и групп гидрофобных изопропиловый из-за гидрофобных взаимодействий. Таким образом всю цепь полимера агрегатов и осаждает4.
В исследовании представлены этот метод используется для разработать модель животных КЦУК, с использованием трех различных ячеек листов. Первый лист занятых состоит из КЦУК клеток линии клетки только, тогда как два других листов состоит из комбинации КЦУК клеток линии клеток и MSCs из двух разных источников: МСК костного мозга (BMMSCs) и пуповины MSCs (UCMSCs). MSCs, не гемопоэтических стромальные клетки, которые способны дифференциации intocell производных мезенхимы линии, включая адипоциты, остеоциты, хондроцитов и миоцитов5. Причина, по которой мы используем эти клетки при создании листа клеток рака является несовместимым отчетности о влиянии MSCs на раковые заболевания. Было высказано мнение о том, что MSCs может иметь два различных фенотипов: «MSC1», провоспалительные фенотип и «MSC2», иммунодепрессивные фенотип6. MSCs Экспресс Толл подобные рецепторы (TLRs). TLR4 грунтовка MSCs увеличивает их секрецию провоспалительных факторов, тогда как TLR3 грунтовка увеличивает их секрецию иммуносупрессивным факторам6. В vitro исследования этих двух фенотипов сообщил, что совместно культуры MSC1 с рак клеточных линий ослабленный рост раковых клеток, в то время как MSC2 совместного культура имела противоположный эффект7. Это подразумевает, что MSCs может быть про рак или противоопухолевых, в зависимости от их фенотип. Таким образом, в дополнение к разработке модели на животных КЦУК, с помощью технологии cell лист, мы хотим изучить влияние MSC пересадки на развитие опухоли, и ли используя эти клетки будут повысить или снизить разработки этой модели.
Обширные количество исследований посвящена разработке адекватной в vivo доклинических животной модели, напоминающий человека раковые заболевания. В настоящее время основные подходы, используемые для создания модели животных рака включают генной инженерии и клеток Трансплантаци?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников экспериментальной хирургии и лабораторных животных в медицинский колледж, Университет короля Сауда, за их сотрудничество и поддержку, особенно Almukhayzim Хуссейн и Хишам Aloudah. Авторы также хотел бы признать СМИ команда университета короля Сауда бин Абдель Азиза для подготовки визуального материала особенно Muath Бен Ганнам и Абдулвахаб Alsulami.
Reagents | |||
FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
Disposables: | |||
15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
Equipment | |||
Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
Biological safety cabinet | Any brand | ||
Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
Sterile surgical tools and nude rats: | |||
Forceps | |||
Scissors | |||
scalpel | |||
Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
Nude rats | Charles river |