Här presenterar vi ett protokoll för att utveckla en i vivo cancer modell använder ark cellteknologi. En sådan modell kan vara mycket användbart för utvärdering av cancer therapeutics.
En i vivo djurmodell som härmar mänskliga cancer kan ha olika program som ger betydande klinisk information. De närvarande används teknikerna för utveckling av in-vivo cancer modeller har betydande begränsningar. Därför i denna studie vill vi genomföra cell ark teknik för att utveckla en modell för i vivo cancer. Hepatocellulär cancer (HCC) är framgångsrikt utvecklat i naken råtta använda cell ark skapas från HCC cell linje celler. De cancer cell arken genereras via intracellulära vidhäftning och bildandet av en skiktad struktur, kontrolleras av extracellulärmatrix. Detta möjliggör HCC ark transplantationen i levern och skapandet av en tumör-bärande djur modell inom en månad. Dessutom utreds rollen av mesenkymala stamceller (MSC) i utvecklingen av denna cancer modell. Utöver bladet HCC cell linje, en annan två cell ark skapas: en ark av HCC celler och benmärgen MSCs (BMMSCs) och ett blad av HCC celler och navelsträngen MSCs (UCMSCs). Blad som har en kombination av både HCC celler och MSCs är också kan producera en tumör-bärande djur. Men tillägg av MSCs minskar storleken på bildade tumören, och denna negativa effekt på tumörutveckling varierar beroende på den använda MSCs’ källa. Detta indikerar att en cellagret som gjorts av vissa MSC undertyper kunde utnyttjas i tumör förvaltning och kontroll.
HCC är en primär cancer i levern som är signifikant associerad med dålig prognos. Årligen, nästan en halv miljon nya patienter diagnosen HCC, vilket motsvarar 85% av levercancer patienter världen över1. Hepatocarcinogenesis är inte en enda-form sjukdom; snarare är det en samling av sjukdomar som har olika histopatologiska funktioner och genetiska och genomisk variation, förutom att varierade prognostiska utfall1. De huvudsakliga utmaningarna i utvecklingen av en effektiv terapeutisk strategi för HCC är därför begränsad kunskap om HCC biologi och bristen på en lämplig experimentell djurmodell som kan hjälpa till att förstå detta komplexa sjukdomar. En i vivo djurmodell som härmar mänskliga cancer är nödvändigt för att välja kandidatgener och identifiera prognostiska/prediktiva markörer inblandade i cancer induktion, liksom för att undersöka olika faktorer som kan påverka cancer Svaren till terapeutiska medel.
In vitro cancer studier är fortfarande associerade med stora begränsningar. Detta är på grund av att cancerceller förlorar många av deras in-vivo funktioner när underhålls i kultur. De förändringar som sker till celler in vitro- resultat från avsaknad av hela vävnad fysiologi i en ex vivo -miljö. Cancer cell till cell interaktion (stromaceller, immun, kärlsystemet, epitelial, etc.) inom den tumör mikromiljö reflekterar kraftigt cancer cell egenskaper2. Den tumör mikromiljö kunde ändra cancer cell genen och protein uttryck och fenotypiska egenskaper, förutom angiogenetic och metastatisk potential. Tvådimensionell (2D) i vitro kultur systemet saknar också en lämplig matris, som är nödvändigt att reglera tumör progression. På grund av dessa begränsningar bör således i vivo modeller alltid utnyttjas för att stödja de preliminära resultaten av in vitro- modeller. I denna studie använder vi cell ark teknik för att utveckla en i vivo djurmodell som belyser den fullständiga biologiska processen underliggande HCC.
Mer än ett decennium sedan, etablerat Okanos laboratorium en ny metod för vävnadsteknik baserat på cell ark teknik3. Denna teknik använder tredjeparts en thermo-lyhörd kultur plast för att tillåta reversibel cell adhesion/avlossning genom att kontrollera den ytan vattenavvisande egenskaper. Denna metod tillåter en skonsam skörd av odlade celler i ett intakt tredimensionell (3-D) format (i.e.,cell ark), med en välskött extracellulär matrix (ECM) och cell-till-cell interaktioner. Cell ark tekniken kräver precoating kulturen rätter med en temperatur-känslig polymer poly(N-isopropylacrylamide) (PIPA är), vilket är kommersiellt tillgänglig och redo för användning. Vid en temperatur under 20 ° C, PIPA är polymerer blir återfuktad och lös i vattenlösningar, vid en högre temperatur (37 ° C), polymerer bli uttorkad och omvandla till en grumlig fällning. Polymeren innehåller hydrofil amide kedjor och hydrofoba sida kedjor (isopropyl grupper). Vid höga temperaturer intensifieras den Brownian rörelsen av vattenmolekylerna, medan, låg temperatur, molekylerna i vattnet kring isopropyl grupperna av fördelningen, hydrerad struktur och grupperna av hydrofoba isopropyl aggregera på grund av hydrofoba interaktioner. Därför hela kedjan av polymeren aggregat och påskyndar4.
I studien presenteras, är denna teknik anställd för att utveckla en HCC djurmodell använder tre olika cell ark. Det första arket anställd består av HCC cell linje celler endast, medan de andra två bladen består av en kombination av HCC cell linje celler och MSCs från två olika källor: benmärg MSCs (BMMSCs) och navelsträngen MSCs (UCMSCs). MSCs är icke-hematopoetiska stromaceller som klarar av att differentiera intocell derivat av mesenkymala härstamning, inklusive adipocyter, osteocyter, kondrocyter och myocyter5. Anledningen till att vi använder dessa celler när du skapar cancer cell arket är inkonsekvent rapportering om effekten av MSCs på cancer. Det har föreslagits att MSCs kan ha två distinkta fenotyper: ”MSC1”, en proinflammatoriska fenotyp, och ”MSC2”, en immunsuppressiv fenotyp6. MSCs express toll-liknande receptorer (TLR). TLR4 priming av MSCs ökar sin utsöndring av proinflammatoriska faktorer, medan TLR3 priming ökar sin utsöndring av immunosuppressiva faktorer6. En in vitro- studie av dessa två fenotyper rapporterade att en samtidig kultur av MSC1 med cancer cellinjer försvagade cancer celltillväxt, medan MSC2 samtidig kultur hade den motsatta effekt7. Detta ifrågasätter att MSCs kan vara antingen Pro cancer eller cancer, beroende på deras fenotyp. Således, förutom att utveckla HCC djur modellen använder ark cellteknologi, vi vill utforska effekten av MSC transplantationer på tumörutveckling, och om du använder dessa celler kommer att öka eller minska utvecklingen av denna modell.
En omfattande mängd forskning är dedikerade till att utveckla en adekvat i vivo prekliniska djurmodell som liknar mänskliga cancerformer. För närvarande innebär de stora strategier som används för att skapa cancer djurmodeller genteknik och cell transplantation11. Genetiskt modifierade djurmodeller är bra verktyg för identifiering och validering av målgener, samt förstå de molekylära mekanismerna bakom läkemedelsinducerad toxicitet. Denna modell är dock associerade med vis…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka personalen av experimentell kirurgi och djur laboratorium vid College of Medicine, King Saud University, för deras samarbete och stöd-särskilt Hussain Almukhayzim och Hisham Aloudah. Författarna vill även berömma media teamet på King Saud bin Abdul-Aziz University för att förbereda visuellt material-särskilt Muath bin Ghannam och Abdulwahab Alsulami.
Reagents | |||
FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
Disposables: | |||
15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
Equipment | |||
Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
Biological safety cabinet | Any brand | ||
Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
Sterile surgical tools and nude rats: | |||
Forceps | |||
Scissors | |||
scalpel | |||
Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
Nude rats | Charles river |