Метод Set реплики: Высок объём подход к количественной мерой Caenorhabditis elegans продолжительность жизни
Summary
Здесь мы описываем метод набора реплик, подход к количественной мерой C. elegans жизни/выживание и healthspan высокой пропускной способности и надежным образом, таким образом позволяя скрининг многих условий без ущерба для качества данных. Этот протокол подробности стратегии и представляет собой программное обеспечение инструмент для анализа данных набора реплик.
Abstract
Метод набора реплик является подход к количественно измерить продолжительность жизни или выживание нематоды Caenorhabditis elegans в духе высокой пропускной способности, таким образом позволяя один следователь на экран более лечения или условий за то же количество время без потери качества данных. Этот метод требует общего оборудования в большинстве лабораторий, работающих с C. elegans и таким образом просто принять. Этот подход центров на опробование независимых выборок населения в каждой точке наблюдения, а не один пример со временем как с традиционными методами продольной. Озвучивание влечет за собой добавление жидкости к скважинам несколькими хорошо плиты, которая стимулирует C. elegans для перемещения и облегчает количественного определения изменений в healthspan. Другие основные преимущества метода набора реплик включают снижение воздействия агар поверхностей переносимых по воздуху загрязнителей (например плесень или грибок), минимальная обработка животных, и надежность на спорадические неправильно озвучивание (например вызов животного как мертвый, когда он по-прежнему жив). Надлежащим образом анализировать и визуализировать данные из набора реплик стиль эксперимент, был также разработан инструмент заказного программного обеспечения. Текущие возможности программного обеспечения включают в себя предоставление кривых выживания как набора реплик и традиционных (Каплана-Мейера) эксперименты, а также статистический анализ для набора реплик. Протоколы, представленная здесь описать традиционные экспериментальный подход и метод набора реплик, а также обзор соответствующего анализа данных.
Introduction
Одним из наиболее трансформативных технологических достижений на пути к пониманию генетическую основу старения является развитие на основе кормления RNAi в C. elegans1; до экспериментального использования РНК-интерференции многие фенотипов старения не были генетически шансов справиться с возникающими. Кормление-на основе RNAi достигается за счет производства двуцепочечной ДНК в E. coli , который соответствует эндогенных C. elegans мРНК: IPTG индуцирует двунаправленный транскрипции через вставки либо C. elegans cDNA или часть кадр в открытом чтения в плазмиду2. Когда C. elegans питаются нетронутыми двуцепочечной ДНК кишечной палочки, производится бактериями перевезены из просвета в кишечной клетки через белка трансмембранного SID-23и затем распространяются через остальную часть животного через SID-14. В каждой ячейке, экзогенных dsRNA обрабатывается Dicer комплекс в siRNA, которые взаимодействуют с зрелой мРНК через дополнительные низкопробный спаривать для создания нового малых интерферирующих РНК мРНК дуплекс. Этот дуплекс признан комплекса RISC и расщепляется, тем самым унижающего достоинство эндогенного мРНК5. Таким образом просто изменив Вставка плазмида, один можно инактивировать функции практически любого гена в геном C. elegans . Это открытие привело к созданию нескольких крупных RNAi кормления-на основе библиотек коллекции преобразован E. coli запасов, которые могут быть объединены для достижения охвата примерно 86% известных C. elegans генов6, 7.
С выдвижением на основе кормления интерференции всеобъемлющей экраны в C. elegans привели к открытию более чем 900 генов, которые изменяют жизни когда инактивированных (что подтверждается RNAi фенотип ассоциаций, куратор в WormBase), который мы называем в качестве gerogenes. Роль для большинства gerogenes в долголетия управления был обнаружен путем кормления-на основе RNAi в нескольких докладах семенных (см. Рисунок 1A и дополнительный файл 1 для подробной информации). В некоторых случаях эти gerogenes были определены на основе измерения жизнеспособности на один или несколько пунктов времени, который не обеспечивает количественной мерой изменения в жизни с лечением RNAi. В других случаях эти гены были количественно оценены изменения в жизни, а также дополнительные связанные возраст фенотипов. К примеру мы определили ранее 159 генов, которые необходимы для нормальной и повышенной продолжительность жизни животных с снижение инсулина/IGF-1 сигнализации и количественно изменения в healthspan. Из них 103 гена inactivations привести к progeric фенотип, поскольку потери привели к один или более признаков преждевременного старения8.
Хотя некоторые gerogenes были связаны с или более 100 исследований (например, daf-16, daf-2, сэр-2.1), свыше 400 gerogenes имеют 10 или меньше цитаты (рис. 1Bи дополнительный файл 2). Таким образом хотя всеобъемлющий кормления-на основе экранов RNAi обнаружили и бегло охарактеризовал сотни предполагаемого gerogenes, как эти функции генов долголетия управления и генетических взаимосвязей между этими продукты гена остаются плохо изучал. Полный продольного анализа для возраста связанные фенотипов является необходимым условием для выявления генетических взаимодействий между gerogenes (например epistatic взаимодействия, asynthetic взаимодействия, и т.д.). Получить более глубокое понимание генетических взаимосвязей между gerogenes требует высокой пропускной способности количественный метод, который также использует преимущества кормления-на основе RNAi.
Наиболее распространенными суррогатной старения определяется продолжительность жизни. Традиционный подход для измерения смертности C. elegans отслеживает гибели отдельных животных со временем в рамках небольшой выборки. Относительно небольшое количество животных идут с течением времени и периодически осторожно ткнул с провода платины или ресниц, с движением как показатель жизнеспособности (рис. 2A). Этот метод широко используется, поскольку она обеспечивает простой, прямые измерения средняя и максимальная продолжительность жизни. Однако этот традиционный метод требует много времени и относительно низкой пропускной способностью, которая ограничивает количество животных и условий, которые могут быть измерены одновременно контролируемым образом. Недавнее исследование моделирование показало, что многие исследования C. elegans жизни не пробирного достаточно большое количество животных, чтобы иметь возможность надежно обнаружить небольшие изменения между условия9. Кроме того этот традиционный метод предполагает неоднократно обработка же когорты животных с течением времени, который в свою очередь может ввести загрязнение и может повредить или убивать животных, неустойчивое, возрасте.
Мы разработали альтернативные «набора реплик» методологию для измерения C. elegans продолжительность жизни. С этой целью большое население возраста синхронизированы, isogenic животных делятся на ряд небольших групп населения (или реплик). Образцы достаточно реплики создаются для покрытия каждый момент запланированного эксперимента. В каждый момент времени наблюдения одна из реплик забил на количество живых мертвецов и цензуре животных, а затем животных в пределах этой репликации удаляются. Таким образом над ожидаемой продолжительность жизни населения в целом, ряд независимых субпопуляций периодически пробы (рис. 2B). В использовании наборов реплик есть нет повторяющихся подталкивая животных и не многократное воздействие потенциального загрязнения окружающей среды. Жизнеспособность, наблюдается в одноразовый точке является полностью независимым от каждого наблюдения, которая минимизирует обработки и увеличивает пропускную способность, по крайней мере на порядок. Это позволило нам чтобы quantitate изменения в жизни для сотни RNAi клоны одновременно8,10.
Здесь мы представляем подробные протоколы для проведения C. elegans жизни через набора реплик и традиционные методы для озвучивания C. elegans долголетия. Мы демонстрируем, что аналогичные результаты получены между методами. У нас есть разработки программного обеспечения для оказания помощи в графическом анализе срок службы данных, получаемых через любой подход, который мы свободно предоставляют под лицензией GPL V3 (см. таблицу материалов). «WormLife» написана в R-11и включает в себя графический интерфейс пользователя (GUI) для построения данных, которая была протестирована в Mac OS и Linux. Наконец мы сравнить и противопоставить недостатки каждого метода и выделить другие соображения при выборе между подходами для измерения количественных изменений в C. elegans продолжительность жизни.
Protocol
Representative Results
Discussion
Набор методы традиционной и реплики требуется синхронизация хронологическом возрасте животных. Мы включить метод, который синхронизирует животных с использованием гипохлорита лечения взрослых, беременных, где только оплодотворенные яйца с беременных взрослого выжить лечения. Эти э?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование для этой работы, описанные в этой рукописи была предоставлена: Университет Рочестер Канцелярии Прево и школа медицины и стоматологии деканат через медицинских наук центр вычислительной инноваций (HSCCI); Эллисон медицинский фонд новых ученых в старения стипендий (АГ-NS-0681-10) спонсоров было никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
References
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
- Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
- Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
- Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2018)
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
- Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
- Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
- Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
- Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).
- Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964 (2014).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).
- Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
- Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
- Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
- Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
- Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
- Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
- Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
