O método de conjunto de réplica: Uma abordagem de alto rendimento para quantitativamente medida Caenorhabditis elegans expectativa de vida
Summary
Aqui descrevemos o método conjunto de réplicas, uma abordagem quantitativamente medida de expectativa de vida/sobrevivência de c. elegans e healthspan de forma robusta e de alta produtividade, permitindo assim a seleção de muitas condições sem sacrificar a qualidade dos dados. Este protocolo detalha a estratégia e fornece uma ferramenta de software para análise de dados do conjunto de réplicas.
Abstract
O método de conjunto de réplicas é uma abordagem para medir quantitativamente a expectativa de vida ou sobrevivência de nemátodos Caenorhabditis elegans em uma maneira de alta produtividade, permitindo assim um único investigador para a tela mais tratamentos ou condições sobre a mesma quantidade de tempo sem perda de qualidade de dados. O método requer equipamento comum encontrado na maioria dos laboratórios que trabalham com c. elegans e, portanto, é simples para adotar. A abordagem centra-se na análise de amostras independentes de uma população em cada ponto de observação, em vez de uma única amostra ao longo do tempo como com métodos tradicionais longitudinais. Marcando implica a adição de líquido para os poços de uma placa multi bem, que estimula a c. elegans para mover e facilita a quantificação de alterações em healthspan. Outros benefícios principais do conjunto de réplicas método incluem menor exposição das superfícies de ágar de contaminantes no ar (por exemplo, mofo ou fungos), mínimo de manipulação dos animais e robustez para mis marcando esporádicas (como chamar um animal morto, quando ainda é vivo). Apropriadamente, analisar e visualizar os dados de uma experiência de estilo de conjunto de réplicas, uma ferramenta de software personalizado também foi desenvolvida. Recursos atuais do software incluem plotagem de curvas de sobrevivência para tanto conjunto de réplicas e tradicional (Kaplan-Meier) experiências, bem como a análise estatística para o conjunto de réplicas. Os protocolos fornecidos aqui descrevem a tradicional abordagem experimental e o método de conjunto de réplicas, bem como uma visão geral da análise de dados correspondente.
Introduction
Um dos avanços tecnológicos mais transformadoras para a compreensão da base genética do envelhecimento foi o desenvolvimento de RNAi alimentação baseada em c. elegans1; antes da utilização experimental de RNAi, muitos fenótipos de envelhecimento não eram geneticamente tractable. RNAi baseada em alimentação é conseguida através da produção de dsRNA dentro Escherichia coli que corresponde a um endógeno mRNA de c. elegans : IPTG induz transcrição bidirecional através de uma inserção do cDNA de c. elegans ou ou uma porção de um frame de leitura aberto dentro de um plasmídeo2. Quando c. elegans alimentam-se intacta dsRNA Escherichia coli, produzido por bactérias é transportado do lúmen intestinal células através de de proteínas transmembranares o SID-23e então distribuído pelo resto do animal através de de SID-14. Dentro de cada célula, dsRNA exógeno é processado pelo complexo a Dicer em siRNA, que interagem com um mRNA maduro através do emparelhamento base complementar para criar um novo duplex siRNA-mRNA. Este duplex é reconhecido pelo complexo RISC e clivada, desse modo degradante o mRNA endógeno5. Assim, alterando apenas a inserção do plasmídeo, um pode desativar a função de quase qualquer gene dentro do genoma de c. elegans . Esta descoberta levada à criação de vários grandes baseada em alimentação RNAi bibliotecas-coleções de transformaram ações de Escherichia coli que podem ser combinadas para atingir a cobertura de aproximadamente 86% do conhecido c. elegans genes6, 7.
Desde o avanço de RNAi baseada em alimentação, telas abrangentes em c. elegans conduziram à descoberta de mais de 900 genes que alteram a expectativa de vida quando inativado (como evidenciado pelas associações de RNAi-fenótipo curadas em WormBase), que se referem a como gerogenes. Um papel para a maioria dos gerogenes no controle da longevidade foi descoberto através de RNAi alimentação baseada em poucos relatórios seminais (veja figura 1A e suplementar 1 arquivo para detalhes). Em alguns casos, estes gerogenes foram identificadas com base em medir a viabilidade em um único ou alguns pontos de tempo, que não constituiu uma medida quantificável da mudança de expectativa de vida com o tratamento de RNAi. Em outros casos, estes genes foram avaliados quantitativamente para mudanças na expectativa de vida, bem como adicionais fenótipos associados a idade. Por exemplo, identificamos anteriormente 159 genes que eram necessários para o normal e maior expectativa de vida dos animais, com a diminuição da sinalização da insulina/IGF-1 e quantificar alterações em healthspan. Destes, 103 inactivations gene resultam em um fenótipo de nanismo, como perda resultou em um ou mais sinais de envelhecimento prematuro8.
Enquanto alguns gerogenes têm sido associados com 100 ou mais estudos (por exemplo, o daf-16, daf-2, senhor-2.1), mais de 400 gerogenes tem citações de 10 ou menos (figura 1Be 2 de arquivo suplementar). Assim, enquanto abrangente baseado em alimentação RNAi telas têm descoberto e caracterizado superficialmente centenas de gerogenes putativo, como estes função de genes no controle de longevidade e as inter-relações genéticas entre estes produtos de genes permanecem mal estudou. Análise completa longitudinal para fenótipos associados a idade é um pré-requisito para a identificação genéticas interações entre gerogenes (por exemplo, as interações epistatic, asynthetic interações, etc.). Ganhar mais profundo insight sobre as genética das inter-relações entre gerogenes requer um método quantitativo de alto rendimento, que também aproveita as vantagens de RNAi baseada em alimentação.
A medida mais comum de substituto do envelhecimento é a expectativa de vida. A abordagem tradicional para medir a mortalidade de c. elegans rastreia as mortes de animais individuais ao longo do tempo dentro de uma amostra pequena da população. Um número relativamente pequeno de animais é seguido ao longo do tempo e periodicamente é estimulado suavemente com um fio de platina ou Pestana, com o movimento como um indicador de viabilidade (Figura 2A). Este método foi amplamente utilizado, pois fornece medições simples, diretas da média e a longevidade máxima. No entanto, esse método tradicional é demorado e relativamente baixa taxa de transferência, que limita o número de animais e as condições que podem ser medidas simultaneamente de forma controlada. Um recente estudo de simulação encontrou que muitos estudos de vida útil de c. elegans não ensaiar um número grande o suficiente de animais para ser capaz de detectar confiavelmente pequenas alterações entre as condições9. Além disso, esse método tradicional envolve manipulação repetidamente a mesma coorte de animais ao longo do tempo, que por sua vez pode apresentar contaminação e pode danificar ou matar animais cada vez mais frágil, envelhecidos.
Nós desenvolvemos uma metodologia alternativa “conjunto de réplicas” para medir o tempo de vida de c. elegans . Para este efeito, uma grande população de animais de idade-sincronizado, isogénicas são divididas em um número de pequenas populações (ou réplicas). Suficiente amostras de réplica são geradas para cobrir cada ponto de tempo no experimento planejado. Em cada ponto de tempo de observação, uma das réplicas é marcou para o número de mortos vivos e animais censurados e, em seguida, os animais dentro que replicar são descartados. Assim, acabou a vida útil esperada da população como um todo, uma série de subpopulações independentes são periodicamente amostrados (Figura 2B). Usando conjuntos de réplica não há nenhum estímulo repetidas de animais e não há exposição repetida a potencial contaminação ambiental. A viabilidade observada no único ponto é completamente independente de todas as outra observação, o que minimiza o manuseio e aumenta a taxa de transferência pelo menos uma ordem de magnitude. Isto permitiu-nos dosar alterações na expectativa de vida para centenas de RNAi clones simultaneamente8,10.
Aqui nós apresentamos protocolos detalhados para a realização de expectativa de vida de c. elegans via tanto o conjunto de réplicas e métodos tradicionais para pontuar a longevidade de c. elegans . Vamos demonstrar que resultados semelhantes são obtidos entre os métodos. Nós temos o software desenvolvido para auxiliar na análise gráfica dos dados de expectativa de vida gerados através de qualquer abordagem, que fornecemos gratuitamente sob a licença GPL V3 (ver tabela de materiais). “WormLife” escrito em R11e inclui uma interface de usuário gráfica (GUI) para plotagem de dados, que foi testados no Mac OS e Linux. Por último, podemos comparar e contrastar as limitações de cada método e destacar outras considerações ao escolher entre abordagens para medir as mudanças quantitativas na expectativa de vida de c. elegans .
Protocol
Representative Results
Discussion
Ambos os métodos conjunto tradicionais e réplica requerem a sincronização dos animais cronologicamente envelhecidos. Nós incluímos um método que sincroniza usando tratamento hipoclorito de gravid adultos, onde só os ovos fertilizados com o adulto gravid sobrevivem tratamento de animais. Estes embriões eclodem em suspensão líquida e desenvolvente prendam a primeira fase larval (L1). Após a semeadura L1 animais para alimento (por exemplo, Escherichia coli expressando dsRNA a um gene de interes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiamento para este trabalho descrito neste manuscrito foi fornecido por: o escritório da Universidade de Rochester de The Provost e da escola de medicina e odontologia Dean do escritório através do centro de Ciências da saúde para a inovação computacional (HSCCI); Ellison Medical Foundation estudiosos novo no envelhecimento Fellowship (AG-NS-0681-10) os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
References
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