Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer
Summary
Hier beschreiben wir die Replikatgruppe Methode, Vorgehensweise quantitativ Messen C. Elegans Lebensdauer/überleben und Healthspan in hohem Durchsatz und robuste Art und Weise, so dass Screening von vielen Bedingungen ohne Einbußen bei der Qualität der Daten. Dieses Protokoll beschreibt die Strategie und bietet ein Software-Tool für die Analyse der Replikatgruppe Daten.
Abstract
Die Replikatgruppe Methode ist ein Ansatz zur Messung quantitativ Lebensdauer oder das Überleben von Nematoden Caenorhabditis Elegans in einer Hochdurchsatz-Weise, so dass eine einzelne Forscher mehr Behandlungen oder Bedingungen über die gleiche Menge an den Bildschirm jederzeit ohne Verlust der Qualität der Daten. Die Methode erfordert eine gemeinsame Ausstattung in den meisten Labors arbeiten mit C. Elegans gefunden und ist somit einfach zu verabschieden. Der Ansatz konzentriert sich auf unabhängige Stichproben einer Grundgesamtheit an jedem Aussichtspunkt, anstatt eine einzelne Probe im Laufe der Zeit als mit herkömmlichen longitudinalen Methoden prüfen. Ritzen mit sich bringt, die Zugabe von Flüssigkeit in die Vertiefungen von Multi-well-Platte, die stimuliert C. Elegans zu bewegen und Quantifizierung Änderungen in Healthspan erleichtert. Andere wichtige Vorteile der Replica Set-Methode enthalten reduzierte Exposition von agarflächen in der Luft Schadstoffe (z.B. Schimmel oder Pilz), minimale Umgang mit Tieren und Robustheit auf sporadische MIS scoring (z. B. ein Tier als Tote gefordert, wenn es noch (lebendig). Um angemessen analysieren und Visualisieren von Daten aus einer Replikatgruppe Stil-Experiment, wurde auch eine benutzerdefinierte Software-Tool entwickelt. Aktuelle Funktionen der Software gehören Plotten von Survival-Kurven für sowohl Replikatsatz und traditionellen (Kaplan-Meier) Experimente, sowie statistische Analysen für Replikatsatz. Die Protokolle, die hier zur Verfügung gestellten beschreiben die traditionelle experimentellen Ansatz und Replica Set-Methode sowie einen Überblick über die entsprechenden Daten-Analyse.
Introduction
Die transformative technologischen Fortschritt in Richtung zum Verständnis der genetischen Grundlagen des Alterns gehörte die Entwicklung der Fütterung-basierte RNAi in C. Elegans1; vor den experimentellen Einsatz von RNAi waren viele Phänotypen des Alterns nicht genetisch steuerbar. Fütterung-basierte RNAi wird erreicht durch die Produktion von DsRNA in E. Coli , das entspricht einer endogenen C. Elegans mRNA: IPTG induziert bidirektionale Übertragung über einen Einsatz entweder C. Elegans cDNA oder eine Portion ein Öffnen Sie Leserahmen in ein Plasmid-2. Bei C. Elegans intakt nach einziehen E. Coli DsRNA produziert durch Bakterien aus dem Lumen in Darmzellen über die SID-2 transmembranen Protein3transportiert und dann durch den Rest des Tieres über SID-14verteilt. In jeder Zelle exogene DsRNA verarbeitet durch komplexe Dicer SiRNA, die interagieren mit einem Reife mRNA über komplementäre Basenpaarung zum Erstellen eines neuen SiRNA-mRNA Duplex. Diese Maisonette ist anerkannt von der RISC-komplex und gespalten, so erniedrigend die endogenen mRNA-5. So ändern Sie lediglich das Plasmid einfügen, kann man die Funktion der fast jedes Gen in das Genom von C. Elegans inaktivieren. Diese Entdeckung führte zu die Kreation von mehreren großen Fütterung-basierte RNAi Bibliotheken-Sammlungen von E. Coli Aktien umgewandelt, die kombiniert werden können, um die Reichweite von ca. 86 % erzielen bekannt C. Elegans Gene6, 7.
Seit der Weiterentwicklung der Fütterung-basierte RNAi führten umfassende Bildschirme in C. Elegans zur Entdeckung von mehr als 900 Gene, die Lebensdauer bei inaktiviert (ausweislich der RNAi-Phänotyp Verbände kuratiert in WormBase), zu ändern, die wir beziehen um als Gerogenes. Eine Rolle für die Mehrheit der Gerogenes Langlebigkeit Kontrolle durch Fütterung-basierte RNAi in wenigen bahnbrechenden Berichten entdeckt wurde (siehe Abbildung 1A und ergänzende Datei 1 für Details). In einigen Fällen wurden diese Gerogenes festgestellt, basierend auf der Messung der Rentabilität auf ein einzelnes oder wenige Zeitpunkte, die nicht quantifizierbaren Maß für die Veränderung der Lebensdauer RNAi-Behandlung zur Verfügung zu stellen. In anderen Fällen wurden diese Gene für Veränderungen der Lebensdauer sowie zusätzliche altersassoziierter Phänotypen quantitativ bewertet. Beispielsweise haben wir bisher 159 Gene, die für normale und erhöhte Lebensdauer von Tieren mit verringerten Insulin/IGF-1 Signalisierung waren notwendig, und Änderungen in Healthspan quantifiziert. Von diesen führen 103 gen inaktivierungen progeric Phänotyp, wie ein oder mehrere Zeichen der vorzeitigen Alterung8Verlust führte.
Während einige Gerogenes mit 100 oder mehr Studien (z. B. Daf-16, Daf-2, Sir-2.1) in Verbindung gebracht haben, haben mehr als 400 Gerogenes höchstens 10 Zitate (Abbildung 1 bund ergänzende Datei 2). So umfassende Fütterung-basierte RNAi-Bildschirme haben entdeckt und kursorisch gekennzeichnet Hunderte von vermeintlichen Gerogenes, bleiben wie diese Gene funktionieren auf Langlebigkeit Kontrolle, und die genetischen Zusammenhänge zwischen diesen Genprodukte schlecht studierte. Volle Längsschnittanalyse für altersassoziierter Phänotypen ist eine Voraussetzung für genetische Interaktionen zwischen Gerogenes (z.B. epistatic Interaktionen, Asynthetic Interaktionen, etc.) zu identifizieren. Tiefer Einblick in die genetischen Zusammenhänge zwischen Gerogenes, erfordert eine Hochdurchsatz-quantitative Methode, die auch die Vorteile der Fütterung-basierte RNAi nutzt.
Die häufigsten Surrogat-Maßnahme des Alterns ist Lebensdauer. Der traditionelle Ansatz zur Messung von C. Elegans Sterblichkeit verfolgt den Tod einzelner Tiere im Laufe der Zeit innerhalb einer kleinen Stichprobe. Eine relativ kleine Anzahl von Tieren werden im Laufe der Zeit verfolgt und in regelmäßigen Abständen sind sanft stieß mit einem Platindraht oder Wimpern mit Bewegung als Indikator der Lebensfähigkeit (Abbildung 2A). Diese Methode ist weit verbreitet, da es einfache, direkte Messungen die durchschnittliche und die maximale Lebensdauer bietet. Diese traditionelle Methode ist jedoch zeitaufwendig und relativ niedrigen Durchsatz, die begrenzt die Anzahl der Tiere und Bedingungen, die gleichzeitig in einer kontrollierten Weise gemessen werden können. Eine kürzlich durchgeführte Simulationsstudie festgestellt, dass viele C. Elegans Lebensdauer Studien keine genügend große Zahl von Tieren Assay, kleine Änderungen zwischen Bedingungen9zuverlässig erkennen zu können. Darüber hinaus beinhaltet diese traditionelle Methode Umgang mit immer wieder die gleichen Kohorte von Tieren im Laufe der Zeit, die wiederum kann einzuführen, Kontamination, und kann beschädigen oder zunehmend gefährdet, im Alter von Tieren zu töten.
Wir haben eine alternative “Replica Set” Methode zur Messung von C. Elegans Lebensdauer entwickelt. Zu diesem Zweck eine große Population von Alter synchronisiert, isogenen Tiere gliedern sich in eine Reihe von kleinen Populationen (oder Nachbauten). Genügend Replik Proben werden generiert, um jeden Zeitpunkt in das geplante Experiment zu decken. Jedem Zeitpunkt Beobachtung eines der Replikate ist für die Anzahl der lebenden Toten erzielte und zensierte Tiere, dann Tiere innerhalb dieser replizieren werden verworfen. So über die erwartete Lebensdauer der Bevölkerung als Ganzes, eine Reihe von unabhängigen Subpopulationen sind in regelmäßigen Abständen abgetastet (Abb. 2 b). Bei der Verwendung von Replikatsätzen gibt es kein wiederholtes drängen von Tieren und keine wiederholte Exposition gegenüber potentiellen Kontamination der Umwelt. Die Lebensfähigkeit beobachtet an der einmaligen Stelle ist völlig unabhängig von jeder anderen Beobachtung, das minimiert die Handhabung und erhöht den Durchsatz von mindestens eine Größenordnung. Dies hat uns erlaubt, Änderungen in Lebensdauer quantitate für Hunderte von RNAi gleichzeitig8,10 Klone.
Hier präsentieren wir ausführliche Protokolle für die Durchführung von C. Elegans Lebensdauer über die Replikatgruppe und traditionelle Methoden zur Bewertung von C. Elegans Langlebigkeit. Wir zeigen, dass ähnliche Ergebnisse, zwischen den Methoden erzielt werden. Wir haben entwickelten Software, bei der die grafische Auswertung der Daten, Lebensdauer durch beide Ansätze, die wir frei unter einer GPL V3 Lizenz (siehe Tabelle der Materialien) zur Verfügung. “WormLife” ist in R11geschrieben und enthält eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) für das Plotten von Daten, die in Mac OS und Linux getestet wurde. Zu guter Letzt wir vergleichen und kontrastieren die Grenzen der einzelnen Methoden und andere Überlegungen bei der Wahl zwischen Ansätze zur Messung der quantitativen Veränderungen in C. Elegans Lebensdauer zu markieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die traditionelle und Replica setzen-Methoden erfordern die Synchronisation von chronologisch im Alter von Tieren. Wir sind eine Methode, die Tiere mit Hypochlorit Behandlung von trächtigen Erwachsene, wo nur die befruchteten Eier mit der trächtigen Erwachsene Behandlung überleben synchronisiert. Diese Embryonen schlüpfen in flüssige Suspension und Entwicklungsgeschichtlich im ersten Larvenstadium (L1) verhaften. Nach der Aussaat L1 Tiere auf Nahrung (z.B. E. Coli mit dem Ausdruck ihrer DsRNA zu ei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung dieser Arbeit beschrieben in diesem Manuskript von zur Verfügung gestellt wurde: die University of Rochester-Büro der Propst und der School of Medicine und Dentistry Dekanat über die Health Sciences Center für Computational Innovation (HSCCI); die Ellison Medical Foundation neue Wissenschaftler in alternden Fellowship (AG-NS-0681-10) hatte die Geldgeber keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
References
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
- Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
- Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
- Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2018)
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
- Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
- Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
- Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
- Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).
- Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964 (2014).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).
- Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
- Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
- Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
- Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
- Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
- Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
- Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
