De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur
Summary
Hier beschrijven we de replicaset methode, een benadering tot kwantitatief maatregel C. elegans levensduur/overleving en de healthspan in een high-throughput en robuuste manier, waardoor screening van vele voorwaarden zonder in te boeten op kwaliteit van de gegevens. Dit protocol details van de strategie en biedt een software-instrument voor de analyse van gegevens van de replicaset.
Abstract
De replicaset methode is een benadering van kwantitatief meten van levensduur of voortbestaan van Caenorhabditis elegans nematoden in een high-throughput manier, waardoor een enkele onderzoeker op het scherm meer behandelingen of voorwaarden over dezelfde hoeveelheid tijd zonder verlies van kwaliteit van de gegevens. De methode vereist gemeenschappelijke uitrusting gevonden in de meeste laboratoria die werken met C. elegans en is dus eenvoudig te nemen. De aanpak op de keuring van onafhankelijke monsters van een populatie op elk observatiepunt, in plaats van één sample na verloop van tijd als met traditionele longitudinale methoden gecentreerd. Scoren met zich meebrengt vloeistof toe te voegen aan de putjes van de plaat in een multi goed, die C. elegans om te bewegen stimuleert en vergemakkelijkt quantifying veranderingen in healthspan. Andere grote voordelen van de replicaset methode zijn verminderde blootstelling van agar oppervlakken lucht verontreinigingen (bijvoorbeeld schimmel of schimmel), minimale behandeling van dieren, en bestandheid tegen sporadische mis scoren (zoals het bellen van een dier als dood wanneer het is nog steeds levend). Om op de juiste manier analyseren en visualiseren van de gegevens van een replicaset stijl experiment, was een aangepaste softwaretool ook ontwikkeld. Huidige mogelijkheden van de software omvatten plotten van overleving curven voor zowel replicaset en traditionele (Kaplan-Meier) experimenten, evenals statistische analyse voor de replicaset. De hier bedoelde protocollen beschrijven de traditionele experimentele aanpak en de replicaset methode, evenals een overzicht van de overeenkomstige data-analyse.
Introduction
Een van de meest transformatieve technologische vooruitgang naar het begrip van de genetische basis van veroudering was de ontwikkeling van voeding gebaseerde RNAi in C. elegans1; voorafgaand aan het experimenteel gebruik van RNAi waren vele fenotypes van veroudering niet genetisch hanteerbare. Voeding gebaseerde RNAi wordt bereikt door de productie van dsRNA binnen E. coli die overeenkomt met een endogene C. elegans mRNA: IPTG induceert bidirectionele transcriptie via een tussenvoegsel van ofwel C. elegans cDNA of een gedeelte van een Open leesraam binnen een plasmide-2. Wanneer C. elegans feed op intact is E. coli, dsRNA geproduceerd door bacteriën vervoerd vanaf de lumen in cellen van de darm via de SID-2 transmembraan eiwit3, en vervolgens wordt gedistribueerd door de rest van het dier via SID-14. Binnen elke cel, exogene dsRNA wordt verwerkt door de complexe Dicer in siRNA, die interactie met een volwassen mRNA via complementaire base paren maken een nieuwe siRNA-mRNA duplex. Deze duplex is erkend door de RISC-complex en gekloofd, waardoor de endogene mRNA5vernederende. Dus, door slechts veranderen de plasmide invoegen, kan een inactivering van de functie van bijna elk gen in het genoom van C. elegans . Deze ontdekking leidde tot de oprichting van verschillende grote voederen gebaseerde RNAi bibliotheken-collecties van getransformeerd E. coli -bestanden die kunnen worden gecombineerd om dekking van ongeveer 86% van bekend C. elegans genen6, 7.
Sinds de vooruitgang van voeding gebaseerde RNAi, hebben uitgebreide schermen in C. elegans geleid tot de ontdekking van meer dan 900 genen die levensduur wanneer geïnactiveerd (zoals blijkt uit de verenigingen van de RNAi-fenotype curator in WormBase), die we verwijzen veranderen om als gerogenes. Een rol voor de meerderheid van gerogenes in levensduur besturingselement werd ontdekt door voeding gebaseerde RNAi in slechts een paar baanbrekende rapporten (Zie figuur 1A en aanvullende bestand 1 voor details). In sommige gevallen zijn deze gerogenes gebaseerd op de meting van de levensvatbaarheid op één of een paar punten van de tijd, die niet een kwantificeerbare maatregel van de verandering in levensduur voorzien van RNAi behandeling geïdentificeerd. In andere gevallen, zijn deze genen kwantitatief beoordeeld voor veranderingen in levensduur, evenals extra leeftijd-geassocieerde fenotypen. Bijvoorbeeld, we eerder aangeduid 159 genen die noodzakelijk zijn voor zowel de normale als de verhoogde levensduur van dieren met verminderde insuline/IGF-1 signalering waren, en gekwantificeerd veranderingen in healthspan. Van deze, 103 gen inactivations leiden tot een progeric fenotype, zoals nederlaag in een of meer tekenen van vroegtijdige veroudering8 resulteerde.
Terwijl sommige gerogenes zijn geassocieerd met 100 of meer studies (bijvoorbeeld daf-16, daf-2, sir-2.1), hebben meer dan 400 gerogenes 10 of minder citaten (figuur 1Ben aanvullende bestand 2). Dus, terwijl uitgebreide voeding gebaseerde RNAi schermen hebben ontdekt en vluchtig gekenmerkt honderden vermeende gerogenes, hoe deze functie van genen in de controle van de levensduur en de genetische relaties tussen deze genproducten blijven slecht studeerde. Volledige longitudinale analyse voor leeftijd-geassocieerde fenotypen is een voorwaarde voor het identificeren van genetische interacties tussen gerogenes (b.v. epistatic interacties, asynthetic interacties, enz.). Verkrijgen van dieper inzicht in de genetische relaties tussen gerogenes vereist een kwantitatieve methode van hoge-doorvoer, die borduurt ook voort op de voordelen van voeding gebaseerde RNAi.
De meest voorkomende surrogaat maatstaf voor veroudering is levensduur. De traditionele aanpak voor het meten van C. elegans sterfte houdt de dood van individuele dieren na verloop van tijd in een steekproef van een kleine populatie. Een relatief klein aantal dieren na verloop van tijd worden gevolgd en regelmatig zachtjes zijn geprikt met een platina-draad of wimper, met beweging als een indicator van de levensvatbaarheid (figuur 2A). Deze methode heeft wijd gebruikt, want het biedt eenvoudige, directe metingen van het gemiddelde en de maximale levensduur. Deze traditionele methode is echter tijdrovend en relatief lage-doorvoer, die beperkt het aantal dieren en voorwaarden die tegelijkertijd op een gecontroleerde manier kunnen worden gemeten. Een recente studie van de simulatie vond dat veel C. elegans levensduur studies niet een groot genoeg aantal dieren om betrouwbaar detecteren van kleine veranderingen tussen voorwaarden9te kunnen doen assay. Deze traditionele methode omvat bovendien herhaaldelijk hanteren dezelfde cohort behoren van dieren na verloop van tijd, die op zijn beurt kan besmetting, introduceren en kunnen beschadigen of steeds fragiele, leeftijd dieren te doden.
We hebben een alternatieve “replicaset” methode voor het meten van C. elegans levensduur ontwikkeld. Te dien einde een grote populatie van leeftijd-gesynchroniseerd, isogene dieren zijn onderverdeeld in een aantal kleine populaties (of replica’s). Genoeg replica monsters worden gegenereerd voor elk punt van de tijd in de geplande experiment. Op elk tijdstip van waarneming, worden een van de replica’s is georkestreerd voor het aantal leven, dood en gecensureerde dieren en dieren binnen die repliceren verwijderd. Dus, meer dan de verwachte levensduur van de bevolking als geheel, een aantal onafhankelijke subpopulaties vormen regelmatig bemonsterd (figuur 2B). Bij het gebruik van replicasets is er geen herhaalde porren van dieren en geen herhaalde blootstelling aan potentiële verontreiniging van het milieu. Er wordt ook de levensvatbaarheid waargenomen bij de eenmalige punt volledig onafhankelijk van elke opmerking over een ander, die behandeling minimaliseert en verhoogt de doorvoer door ten minste een orde van grootte. Dit hebben wij kunnen kwantificeren veranderingen in levensduur voor honderden RNAi tegelijkertijd8,10 klonen.
Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor het uitvoeren van C. elegans levensduur via zowel de replicaset en de traditionele methoden voor het scoren van C. elegans levensduur. We laten zien dat vergelijkbare resultaten worden verkregen tussen de methoden. We hebben software ontwikkeld om te helpen in de grafische analyse van gegevens van de levensduur gegenereerd door beide aanpak, waarmee we vrij onder een GPL V3-licentie (Zie tabel van materialen). “WormLife” is geschreven in11, en bevat een grafische gebruikersinterface (GUI) voor het uitzetten van gegevens, die is getest in Mac OS en Linux. Tot slot, wij vergelijken en contrast van de beperkingen van elke methode en markeren van andere overwegingen bij de keuze tussen benaderingen voor het meten van kwantitatieve wijzigingen in C. elegans levensduur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zowel de traditionele en replica set methoden vereisen de synchronisatie van chronologisch leeftijd dieren. We nemen een methode waarmee wordt gesynchroniseerd van dieren met behulp van hypochloriet behandeling van gravid volwassenen, waar alleen bevruchte eieren met de gravid volwassene behandeling overleven. Deze embryo’s uitkomen in vloeibare suspensie en ontwikkelingsachterstand aanhouding op de eerste larvale stadium (L1). Na het zaaien L1 dieren op voedsel ( E. coli bijvoorbeeld waarin dsRNA naar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering voor dit werk beschreven in dit manuscript werd verstrekt door: het Bureau van de Universiteit van Rochester van de Proost en de School van geneeskunde en tandheelkunde Dean’s Office via de Health Sciences Center voor computationele innovatie (HSCCI); de Ellison medische Foundation nieuwe geleerden in Aging Fellowship (AG-NS-0681-10) de financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
References
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
- Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
- Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
- Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2018)
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
- Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
- Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
- Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
- Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).
- Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964 (2014).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).
- Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
- Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
- Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
- Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
- Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
- Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
- Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
