El método de conjunto de réplica: Un enfoque de alto rendimiento para cuantitativamente medida Caenorhabditis elegans vida útil
Summary
Aquí describimos el método Replica Set, un enfoque cuantitativo medida vida útil/supervivencia de C. elegans y healthspan en forma robusta y de alto rendimiento, permitiendo la proyección de muchas condiciones sin sacrificar la calidad de los datos. Este protocolo detalla la estrategia y proporciona una herramienta de software para análisis de datos de conjunto de réplica.
Abstract
El método de conjunto de réplica es un enfoque para medir cuantitativamente vida útil o la supervivencia de los nematodos Caenorhabditis elegans en un modo de alto rendimiento, permitiendo que un solo investigador para más tratamientos o condiciones sobre la misma cantidad de tiempo sin pérdida de calidad de los datos. El método requiere equipos comunes en la mayoría de los laboratorios trabajando con C. elegans y así es fácil de adoptar. El enfoque se centra en análisis de muestras independientes de una población en cada punto de observación, en lugar de una sola muestra en el tiempo como con métodos tradicionales y longitudinales. Que implica la adición de líquido en los pocillos de una placa multi-bien, que estimula la C. elegans para mover y facilita la cuantificación de cambios en healthspan. Otros importantes beneficios del método Replica Set incluyen la exposición reducida de la superficie del agar a contaminantes en el aire (e.g. moho u hongo), manejo de animales y robustez a esporádicos mal anotar (como llamar a un animal como muerto cuando aún es mínima viva). Para adecuadamente, analizar y visualizar los datos de un experimento de estilo de conjunto de réplica, también se desarrolló una herramienta de software a la medida. Capacidades actuales del software incluyen ploteo de curvas de supervivencia para tanto réplica establecido y tradicional (Kaplan-Meier) experimentos, así como el análisis estadístico de conjunto de réplica. Los protocolos que aquí describen el enfoque experimental tradicional y el método Replica Set, así como un resumen de los análisis de datos correspondientes.
Introduction
Uno de los avances tecnológicos más transformadoras hacia la comprensión de la base genética del envejecimiento era el desarrollo de alimentación basado en RNAi en la C. elegans1; antes del uso experimental de RNAi, muchos fenotipos de envejecimiento no eran genéticamente manejables. Alimentación basado en RNAi se logra a través de la producción de dsRNA dentro de e. coli que coincide con un endógeno mRNA de C. elegans : IPTG induce la transcripción bidireccional a través de una inserción del cDNA de C. elegans u o una porción de un marco de lectura abierto dentro de un plásmido2. Cuando C. elegans se alimentan intacto dsRNA de e. coli, producida por bacterias es transportado de la luz en las células intestinales a través de la proteína transmembrana de SID-23y luego distribuido por el resto de los animales a través de SID-14. Dentro de cada célula, dsRNA exógeno es procesado por el complejo Dicer en siRNA, que interactúan con un mRNA maduro por apareamiento complementario de la base para crear un nuevo dúplex siRNA-mRNA. Este dúplex es reconocido por el complejo RISC y troceado, así degradando el mRNA endógeno5. Así, cambiando sólo la inserción de plásmidos, puede desactivar la función de casi cualquier gen dentro del genoma de C. elegans . Este descubrimiento conducido a la creación de varios grandes RNAi basada en alimentación transforman de colecciones de las bibliotecas de poblaciones de e. coli que pueden combinarse para lograr una cobertura de aproximadamente el 86% de conocidos genes de C. elegans 6, 7.
Desde el avance de alimentación basado en RNAi, pantallas completa en C. elegans han llevado al descubrimiento de más de 900 genes que alteran la vida cuando inactivado (según lo evidenciado por las asociaciones de ARNi-fenotipo curadas en WormBase), que llamamos a como gerogenes. Un papel para la mayoría de gerogenes en el control de la longevidad fue descubierto a través de la alimentación basado en RNAi en pocos informes seminales (ver figura 1A y 1 archivo suplementario para más detalles). En algunos casos, estos gerogenes han sido identificados basados en medir la viabilidad en un solo o unos pocos puntos del tiempo, que no proporciona una medida cuantificable del cambio en la esperanza de vida con tratamiento de RNAi. En otros casos, estos genes han sido evaluados cuantitativamente los cambios en vida útil, así como los fenotipos adicionales asociados con la edad. Por ejemplo, anteriormente se identificaron 159 genes que eran necesarios para la normal y mayor vida útil de los animales con disminución de la señalización de insulina/IGF-1 y cuantificaron cambios en healthspan. De estos, 103 inactivations gene causar un fenotipo progeric, como dio lugar la pérdida de uno o más signos de envejecimiento prematuro8.
Mientras que algunos gerogenes se han asociado con 100 o más estudios (e.g. daf-16, daf-2, sir-2.1), gerogenes más de 400 tienen 10 o menos referencias (figura 1By 2 archivo suplementario). Por lo tanto, si bien completa basada en alimentación ARNi pantallas han descubierto y caracterizado someramente cientos de supuestos gerogenes, cómo la función de estos genes en el control de la longevidad y las correlaciones genéticas entre estos productos génicos siguen mal estudió. Análisis completo longitudinal de fenotipos asociados con la edad es un requisito previo para la identificación de las interacciones genéticas entre gerogenes (p. ej. las interacciones epistáticas, interacciones asynthetic, etcetera). Aumentar la comprensión más profunda en las interrelaciones genéticas entre gerogenes requiere de un método cuantitativo de alto rendimiento, que también aprovecha las ventajas de la alimentación basado en RNAi.
La medida más común del sustituto del envejecimiento es vida. El enfoque tradicional para medir la mortalidad de C. elegans pistas de la muerte de animales individuales con el tiempo dentro de una muestra pequeña de la población. Un número relativamente pequeño de animales se sigue en el tiempo y periódicamente es empujado suavemente con un alambre de platino o con pestañas, con movimiento como indicador de viabilidad (figura 2A). Este método ha sido ampliamente utilizado, ya que proporciona mediciones directas, directas de la media y la máxima vida útil. Sin embargo, este método tradicional es desperdiciador de tiempo y relativamente de bajo rendimiento, que limita el número de animales y de las condiciones que se pueden medir simultáneamente de forma controlada. Un estudio de simulación reciente encontró que muchos estudios de vida de C. elegans no ensayo un número suficientemente grande de animales para poder detectar de manera fiable pequeños cambios entre condiciones9. Además, este método tradicional incluye repetidamente una misma cohorte de animales con el tiempo, que a su vez puede introducir contaminación y puede dañar o matar animales cada vez más frágiles, envejecidos.
Hemos desarrollado una metodología alternativa “Replica Set” para medir la vida de C. elegans . Para ello, una gran población de edad-que sincronizados, isogénicas animales se dividen en un número de pequeñas poblaciones (o réplicas). Suficientes muestras de réplica se generan para cubrir cada punto del tiempo en el experimento planeado. En cada momento de observación, una de las réplicas se anotó el número de la vida, muertos y animales censurados y animales dentro de esa repetición se descartan. Por lo tanto, sobre la vida útil esperada de la población en su conjunto, una serie de subpoblaciones independientes son periódicamente muestreadas (figura 2B). En el uso de conjuntos de réplicas no hay ninguna insistencia repetida de los animales y no la exposición repetida a la potencial contaminación ambiental. La viabilidad en el único punto es totalmente independiente de cada otra observación, que minimiza el manejo y aumenta el rendimiento en al menos un orden de magnitud. Esto nos ha permitido cuantificar cambios en la vida, por centenares de RNAi clones simultáneamente8,10.
Aquí presentamos protocolos detallados para la realización de la vida de C. elegans mediante la réplica establecer tanto los métodos tradicionales de recuento de longevidad de C. elegans . Nos demuestran que se obtienen similares resultados entre los métodos. Contamos con software desarrollado para ayudar en el análisis gráfico de datos de vida útil generados a través de cualquiera de los dos, que ofrecemos libremente bajo licencia GPL V3 (véase tabla de materiales). “WormLife” está escrito en R11e incluye una interfaz gráfica de usuario (GUI) para el trazado de los datos, que se ha probado en Mac OS y Linux. Por último, comparar y contrastar las limitaciones de cada método y resaltar otras consideraciones al elegir entre los enfoques para medir los cambios cuantitativos en la vida de C. elegans .
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos sets tradicionales y réplica requieren la sincronización de animales cronológicamente envejecidas. Se incluye un método que sincroniza animales con tratamiento de hipoclorito de adultos grávidos, donde sólo los huevos fertilizados con el adulto grávido sobreviven el tratamiento. Los embriones eclosionan en suspensión líquida y detención de desarrollo en el primer estadio larval (L1). Después de la siembra L1 animales en alimentos (por ejemplo e. coli expresando dsARN a un gen de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación para este trabajo se describe en este manuscrito fue proporcionada por: la oficina de la Universidad de Rochester del rector y la Facultad de medicina y odontología Decanato mediante el centro de Ciencias de la salud innovación computacional (HSCCI); el Ellison médico nuevo de becados de Fundación en Aging Fellowship (AG-NS-0681-10) los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
References
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