アメーバを用いた急速なイメージに基づく細菌の病原性試験
Summary
ここでは、ホストとしてD. キイロタマホコリカビ(アメーバ) を用いた浮遊性や表面に接続された細菌の病原性を測定するためのプロトコルを提案する.1 時間の期間にわたって病原性を測定し、ホストを殺すは、蛍光顕微鏡、画像解析を用いた定量化されます。緑膿菌を使用してこのプロトコルを示す.
Abstract
伝統的な細菌の病原性アッセイは、宿主細胞に数時間にわたって細菌の長期暴露を含みます。この時、細菌はホスト生育環境への暴露と宿主細胞の存在のための生理学の変更を受けることができます。細菌が宿主細胞の存在下で成長する範囲を最小限にする細菌の病原性の状態を迅速に測定するアッセイを開発しました。細菌やアメーバ一緒に、寒天のパッドを使用して単一画像平面に固定化しました。手順は、ホスト細胞の健康の指標としてカルセイン-アセトキシメチルセファロスポリン エステル (カルセイン AM) と単一細胞の蛍光イメージングを使用します。宿主細胞の蛍光は、落射蛍光顕微鏡による細菌の宿主細胞の露出の 1 時間後に分析されます。画像解析ソフトを使用して、ホスト殺害のインデックスを計算します。このメソッドは、浮遊性と表面に接続された緑膿菌の病原性を測定するために使用されていますバイオ フィルム形成の初期段階でのサブ集団と他の細菌とバイオ フィルムの成長の他のステージに適応があります。このプロトコル病原性を測定する迅速で堅牢な方法を提供し、成長と哺乳類セルラインの維持に関連する複雑さの多くを回避できます。病原性表現型を用いてここでアメーバもマウスのマクロファージを使用して検証されています。特に、このアッセイは、膿が付着 upregulates 病原性を確立する使用されました。
Introduction
細菌感染は、人間と動物の1,2の死亡率の主要な原因のひとつです。文化やバイオ フィルム中の細菌の毒性を測定する能力は、医療と研究の設定で重要です。ここでは、細菌の病原性を定量化する汎用性の高い、迅速かつ比較的簡単な方法をについて説明します。真核生物キイロタマホコリカビ(アメーバ) は、ホストのモデル有機体として使用されます。D. キイロタマホコリカビは、緑膿菌(P. aeruginosa)3,4,5その他細菌6,7 病原性因子を同定するホストとして使用されています ,8タイプ III 分泌9,10を含む哺乳類の細胞を殺す病原因子が同じ主に影響を受けやすい。D. キイロタマホコリカビを使用して前の病原性アッセイは、時間3,4、5のコース上D. キイロタマホコリカビの細胞と細菌の長期暴露を関与しています。ここでは、プロトコルこのアメーバを使用して病原性を決定する急速な手法を提案します。(図 1) このプロトコルを記述する方法: (1) axenically (細菌の不在) のアメーバを成長、(2) 試金のための細菌の成長, (3) 細菌の準備、顕微鏡、(4) のホスト細胞を落射蛍光顕微鏡を実行および (5) アメーバの分析蛍光。
アメーバ最初凍結する在庫からを縞になる、エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) の芝生上に成長した、アメーバが胞子を作り出します。これらの胞子が選ばれ、無菌成長用濃縮培地に接種します。細菌の病原性の評価のための細菌と混合する準備ができるまで、栄養豊富な条件で無菌の成長を通じて、アメーバが維持されます。生存率や、アメーバの死は、カルセイン-アセトキシメチルセファロスポリン (カルセイン AM) で、細胞内エステラーゼによって切断され、蛍光11,12の活性化により、蛍光を測定することによって定量化されます。強調したに対し、ライブ アメーバがほとんど、あるいはまったく蛍光を展示し、死細胞蛍光激しくないです。この結果は、ほとんどあるいは全く健全なアメーバと定款にカルセイン AM 定款と胸の谷間強調したアメーバ13で基板の原因です。この現象は、特に哺乳類セル11,14,,1516カルセイン AM 蛍光から区別されます。
細菌の病原性を評価することは、別に栽培しています。ここでは、膿の日和見病原体の病原性を測定し、浮遊性 (水泳) および表面接続型のサブ集団の病原性を定量化する方法について詳しく説明する方法をについて説明します。このプロトコルは、他の細菌の病原性をテストに適応させること。病原性表面接続型セルでアクティブにされ浮遊性細胞では低いことを示す代表結果セクションで以前13に報告しました。表面接続型の病原性活性化膿は、非病原性の浮遊性細胞が、アメーバによって消費されている間にアメーバを殺します。浮遊性細菌の病原性は試金されるだけ、細菌がプロトコルで説明されているようにペトリ皿を使用するのではなく、普通の培養管で培養することができます。
アメーバや膿文化の成長は、膿の文化、アメーバは定常状態の栄養豊富な条件で育っている間目的の成長フェーズに到達するように調整しなければなりません。この状態は通常、細菌と混合されるとき、少なくとも 1 日前に希釈するアメーバ文化を必要です。アメーバや細菌寒天パッドを使用して固定、1 h の共同培養、低解像度 (10 X 開口数 0.3) 客観的、緑色蛍光タンパク質 (GFP) をフィルターして撮像カメラを使用してイメージを作成します。分析は、ImageJ の自由に利用できるソフトウェアを使用して実行することができます。 または、画像解析ソフトをカスタマイズします。我々 の分析は、科学的な分析パッケージ13を使用して作成された独自のソフトウェアを使用して行った。ソフトウェア位相コントラストを使用してマスクを作成し、蛍光画像のマスクされた領域から蛍光値を抽出.蛍光値の少なくとも 100 の細胞、数値ホスト殺害のインデックスの結果を平均値します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、膿で病原性を試金する迅速・定量法について説明します。このプロトコルは、他の細菌テスト可能性があります。ただし、成長媒体がアメーバの成長条件と互換性があることを留意することが重要です。特に、我々 は細菌の成長媒体として PS:DB を使用してプロトコルを最適化してきました。その他のメディアを使用している場合、細菌細胞培地が、アメーバと?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KP と書き、原稿を改訂します。KP は、実験と解析を実行します。この作品は、名前を付けてに国立衛生研究所 (NIH) キャリア遷移賞 (K22AI112816) によって支えられました。
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -. P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O’Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
