Amip kullanarak bir yansıma tabanlı hızlı bakteriyel virülans tahlil
Summary
Burada, D. discoideum (amip) ana bilgisayar olarak kullanarak planktonik veya yüzey bağlı bakterilerin virülans ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Virülans bir 1 saat boyunca ölçülür ve öldürme ana bilgisayar floresans mikroskobu ve görüntü analizi ile sayılabilir. Biz bakteri P. aeruginosabu iletişim kuralı’nı göstermek.
Abstract
Geleneksel bakteriyel virülans deneyleri konak hücreleri için birkaç saat boyunca uzun süre maruz bakteri içerir. Bu süre içinde bakteri fizyolojisi ana büyüme ortamı maruz ve konak hücreleri varlığı nedeniyle değişiklikleri uygulayabilir. Biz hızla hangi bakteri varlığında konak hücreleri büyümek ölçüde en aza indirmek bakteri virülans durumunu ölçmek için bir tahlil geliştirilmiştir. Bakteri ve amip birlikte karışık ve agar panelini kullanma tek bir görüntüleme uçağı üzerinde immobilize. Yordam tek hücreli floresans görüntüleme (calcein-AM) calcein-acetoxymethyl ester ile konak hücre sağlık bir göstergesi olarak kullanır. Konak hücreleri floresan 1s epifluorescence mikroskobu kullanılarak bakteri konak hücre maruz sonra analiz edilir. Görüntü analiz yazılımı bir ana bilgisayar öldürme Dizin hesaplamak için kullanılır. Bu yöntem virülans planktonik ve yüzey bağlı Pseudomonas aeruginosa içinde ölçmek için kullanılan ilk aşamasında alt nüfus biyofilm oluşumu ve diğer bakteri ve diğer aşamaları biyofilm büyüme için adapte edilebilir. Bu iletişim kuralı virülans ölçmenin hızlı ve sağlam bir yöntem sağlar ve büyüme ve bakım memeli hücre hatları ile ilgili karmaşıklığı çoğunu önler. Burada amip kullanarak ölçülen virülans fenotipleri da fare makrofajlar kullanarak doğrulanmış. Özellikle, bu tahlil bu yüzey ek upregulates virülans P. aeruginosaiçinde kurmak için kullanıldı.
Introduction
Bakteriyel enfeksiyon, insan ve hayvan1,2‘ deki ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Sağlık ve araştırma ayarlarında önemli virülans bakteri kültürleri veya biyofilmler ölçmek için yeteneğidir. Burada, bakteriyel virülans ölçmek için çok yönlü, hızlı ve nispeten basit bir yöntem açıklanmaktadır. Ökaryotik organizma Dictyostelium discoideum (amip) modeli ana bilgisayar organizma olarak kullanılır. D. discoideum virülans faktörleri Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)3,4,5 ve diğer bakteriler6,7 tanımlamak için ana bilgisayar olarak kullanılmıştır ,8 ve tip III salgı9,10da dahil olmak üzere memeli hücreleri öldürmek büyük ölçüde aynı virülans faktörleri için açıktır. D. discoideum kullanarak önceki virülans deneyleri bakteri D. discoideum hücreleri ile uzun süre maruz saat3,4,5boyunca işe. İletişim kuralı, burada, bu amip kullanarak virülans belirleme hızlı bir yöntem sunuyor. Bu iletişim kuralı (Şekil 1) açıklar nasıl yapılır: (1) axenically (içinde bakteri yokluğu) amip büyümek, (2) bakteri tahlil için büyümek, (3) bakteri hazırlamak ve konak hücreleri mikroskobu, (4) için epifluorescence mikroskobu gerçekleştirmek ve analiz (5) amip Floresan.
Amip başlangıçta donmuş stokları çizgili ve nerede amip Sporlar üretmek Escherichia coli (e.coli), çim üzerinde büyüdü. Bu sporlar aldı ve axenic büyüme için zenginleştirilmiş bir orta içine aşılandı. Bakteriyel virülans değerlendirilmesi için bakteri ile karışık olması hazır olana amip besin açısından zengin koşullarında axenic büyüme ile korunur. Hayatta kalma ya da amip ölümü, calcein-acetoxymethyl (calcein-AM), hücre içi esterazlar tarafından i ciddi ve, böylece, floresans11,12için aktif floresans ölçerek sayılabilir. Canlı amip vurguladı ise az veya hiç floresans sergi ve yoğun bir şekilde ölen hücreleri bulabilsem. Calcein-AM sağlıklı amip ve birleşme içine çok az veya hiç birleşme ve stresli amip13‘ te substrat bölünme nedeniyle sonucudur. Bu davranış özellikle calcein-AM floresans memeli hücreleri11,14,15,16ayrıdır.
Virülans için değerlendirilecektir bakteri ayrı olarak yetiştirilmektedir. Burada, P. aeruginosa fırsatçı patojen virülans ölçmek ve ayrıntılı nasıl virülans planktonik (yüzme) ve yüzey bağlı alt nüfus ölçmek için nasıl açıklar. Bu iletişim kuralı diğer bakteri virülans sınamak için adapte olabilir. Temsilcisi sonuçları bölümünde gösterdiğimiz virülans yüzey bağlı hücrelerde aktif ve planktonik hücrelerde, düşük olduğu daha önce13bildirdi. Öldürücü olmayan planktonik hücreleri amip tarafından tüketilen iken yüzey bağlı P. aeruginosa virülans-harekete geçirmek amipler öldürür. Planktonik bakteri virülans yalnızca denetlesinler, bakteri Petri yemekler iletişim kuralında açıklandığı gibi kullanarak yerine sıradan Kültür tüpleri kültürlü olabilir.
Öyle ki kararlı duruma besin açısından zengin koşullarında, amip büyümeye ederken P. aeruginosa kültürler ve hedeflenen büyüme aşamasında ulaşmak, amip ve P. aeruginosa kültürler koordine edilmelidir. Bu durum genellikle amip kültürler bakterilerle karışınca en az 1 gün önce seyreltilmiş gerekir. Amip ve bakteri agar pedleri kullanarak immobilize, Co için 1 saat inkübe ve düşük çözünürlüklü (10 X, sayısal diyafram 0,3) objektif, yeşil floresans protein (GFP) filtre uygular ve görüntüleme bir kamera kullanarak yansıma. Analizi serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılım kullanılarak gerçekleştirilebilir veya görüntü analiz yazılımı özelleştirilebilir. Bizim analiz bilimsel analiz paketi13kullanılarak yazılmış kendi yazılımını kullanarak gerçekleştirildi. Yazılım faz kontrast görüntü kullanarak maske oluşturmak ve floresan görüntünün maskelenmiş alanlar floresans değerleri ayıklamak gerekir. Floresans değerler bir sayısal ana bilgisayar öldürme dizininde kaynaklanan en az 100 hücreleri üzerinde ortalama.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı virülans P. aeruginosaiçinde tahlil hızlı ve nicel yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı ile diğer bakteri test edilebilir. Ancak, büyüme orta amip büyüme koşulları ile uyumlu olması gerektiğini akılda tutmak önemlidir. Özellikle, PS:DB bakteriyel büyüme aracı olarak kullanan Protokolü optimize. Diğer medya kullanılması halinde, hiçbir bakteri hücreleri orta amip ile uyumlu olduğunu doğrulamak için mevcut olan bir büyüme sadece medya denetimi gerçekleşti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KP ve AS yazdı ve el yazması yeniden düzenlendi. KP deneyler ve analizi yapılır. Bu eser as için Ulusal Enstitüsü Sağlık (NIH) kariyer geçiş Ödülü (K22AI112816) tarafından desteklenmiştir
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -. P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O’Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
