En snabb Image-baserad bakteriell virulens analys med hjälp av amöba
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att mäta virulens hos plankton eller surface-anslutna bakterier använda D. discoideum (amöba) som värd. Virulens mäts över en period på 1 h och värd döda kvantifieras med hjälp av fluorescence mikroskopi och bild analys. Vi visar detta protokoll som använder bakterien P. aeruginosa.
Abstract
Traditionella bakteriell virulens analyser innebär långvarig exponering av bakterier under loppet av flera timmar till värdceller. Under denna tid, kan bakterier genomgå förändringar i fysiologi på grund av exponering för tillväxt värdmiljön och förekomsten av vara värdcellerna. Vi utvecklat ett test för att snabbt mäta tillståndet virulens av bakterier som minimerar den utsträckning som bakterier växa i närvaro av värdceller. Bakterier och endoparasiterna blandas ihop och orörlig på en enda bildplanen använder en agar-pad. Proceduren använder encelliga fluorescens imaging med calcein-acetoximetyl ester (calcein-AM) som en indikator på värden cell hälsa. Fluorescensen av värdceller analyseras efter 1 h exponering av värdceller att bakterierna med epifluorescence mikroskopi. Bild analys programvara används för att beräkna en värd dödande index. Denna metod har använts för att mäta virulens inom plankton och surface-anslutna Pseudomonas aeruginosa delpopulationer under det inledande skedet av biofilm bildning och kan anpassas till andra bakterier och andra stadier av biofilm tillväxt. Detta protokoll ger en snabb och robust metod att mäta virulens och undviker många av svårigheterna som förknippas med tillväxt och underhåll av däggdjursceller linjer. Virulens fenotyper mätt här med endoparasiterna har också validerats med hjälp av musen makrofager. I synnerhet för denna analys att fastställa att ytan fastsättning uppreglerar virulens i P. aeruginosa.
Introduction
Bakteriell infektion är en av de ledande dödsorsakerna i människa och djur1,2. Förmågan att mäta virulens av bakterier i kulturer eller biofilmer är viktigt i sjukvård och forskning inställningar. Här beskriver vi en mångsidig, snabb och relativt enkel metod för att kvantifiera bakteriell virulens. Den eukaryota organismen Dictyostelium discoideum (amöba) används som modell värd organismen. D. discoideum har använts som en värd för att identifiera virulensfaktorer i Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)3,4,5 och andra bakterier6,7 ,8 och är mottagliga för i stort sett de samma virulensfaktorer som döda däggdjursceller inklusive typ III sekretion9,10. Tidigare virulens analyser med hjälp av D. discoideum har involverat långvarig exponering av bakterier med D. discoideum celler under loppet av timmar3,4,5. Protokollet, här presenterar en snabb metod för att bestämma virulens använder denna amöba. Detta protokoll (figur 1) beskriver hur du: (1) växer endoparasiterna axenically (i avsaknad av bakterier), (2) växa bakterier för analysen, (3) förbereda bakterier och värdceller för mikroskopi, (4) utföra epifluorescence mikroskopi och (5) analysera amoeba fluorescens.
Endoparasiterna är initialt stryks ut från fryst lager och odlas på en gräsmatta av Escherichia coli (E. coli), där endoparasiterna producera sporer. Dessa sporer plockas och inokuleras i ett berikat medium för axenic tillväxt. Endoparasiterna underhålls genom axenic tillväxt i näringsrika förhållanden tills de är redo att blandas med bakterier för bedömning av bakteriell virulens. Överlevnad eller döden av endoparasiterna kvantifieras genom mätning av fluorescensen av calcein-acetoximetyl (calcein-AM), som klyvs av intracellulära esteraser och, därmed, aktiverad för fluorescens11,12. Levande endoparasiterna uppvisar liten eller ingen fluorescens betonade och döende celler fluorescerar intensivt. Detta resultat beror på en liten eller ingen införlivandet av calcein-AM i friska endoparasiterna och införlivande och klyvning av substratet i stressade endoparasiterna13. Detta är särskilt skild från calcein-AM fluorescens i däggdjursceller11,14,15,16.
Bakterier som kommer att bedömas för virulens odlas separat. Här, beskriver vi hur man mäter virulens opportunistisk patogen P. aeruginosa och detalj hur att kvantifiera virulens plankton (simning) och surface-anslutna delpopulationer. Detta protokoll kan anpassas att testa virulens hos andra bakterier. I avsnittet representativa resultat visar vi att virulens är aktiverad i celler yta-sitter och är låg i plankton celler, som rapporterades tidigare13. Virulens-aktiverade surface-anslutna P. aeruginosa dödar endoparasiterna medan icke-virulent plankton celler förbrukas av endoparasiterna. Om är enbart att analyseras virulens hos plankton bakterier, kan bakterier vara odlade i vanliga kultur rör i stället för att använda petriskålar som beskrivs i protokollet.
Tillväxten av endoparasiterna och P. aeruginosa kulturer måste samordnas så att P. aeruginosa kulturer nå den avsedda tillväxtfasen medan endoparasiterna växer vid steady state i näringsrika förhållanden. Detta tillstånd kräver vanligtvis endoparasiterna kulturer spädas minst 1 dag före när de blandas med bakterier. Endoparasiterna och bakterier är orörlig använder agar kuddar, är samtidig ruvade för 1 h och avbildas med hjälp av en låg upplösning (10 X, numeriska bländaröppningen 0,3) objektiva, grönt fluorescerande protein (GFP) filter och en tänkbar kamera. Analys kan utföras med hjälp av fritt tillgängliga ImageJ programvara eller anpassad bild analys programvara. Vår analys utfördes med hjälp av vår egen programvara som skrivs med hjälp av en vetenskaplig analys paketet13. Programvaran bör skapa en mask som använder fas kontrast bilden och extrahera fluorescens värden från de maskerade områdena i bilden fluorescens. Fluorescens är medelvärdet över minst 100 celler, vilket resulterar i ett index för dödandet av numeriska värden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver en snabb och kvantitativ metod för att assay virulens i P. aeruginosa. Detta protokoll kan testas med andra bakterier. Det är dock viktigt att komma ihåg att odlingsmedium bör vara förenliga med amoeba tillväxten villkorar. Vi i synnerhet har optimerat det protokoll använder PS:DB som bakterietillväxt medium. Om andra medier används, kan det nödvändigt att utföra en tillväxt endast media-kontroll där det finns ingen bakterieceller som är närvarande för att kontroll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KP och som skrev och reviderade manuskriptet. KP utfört experimenten och analys. Detta arbete stöds av National Institutes of Health (NIH) karriär övergång tilldelning (K22AI112816) till AS.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240062 | Aliquot < 1 mL and store at -20 °C |
| Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) | Life Technologies | C34852 | Calcein Acetoxymethyl (AM) |
| Calcium chloride, anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| Special peptone | Oxoid | LP0072 | |
| Potassium hyroxide | Fisher Chemical | P250 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Strains | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn lab | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn lab | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | PA14 | PA14 strain19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn lab | AFS20.1 | PA14-derived strain20 |
| Supplies | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | For filter sterilization |
| Conical tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri dish, 6 cm diameter | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polystyrene plates |
| Petri dish, 10 cm diameter | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Plastic containers with lid | Ziploc | 2.57E+09 | Square 3-cup containers |
| Glass plates | Bio-Rad | 1653308 | For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions. |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | |
| Equipment | |||
| Eclipse Ti-E microscope | Nikon | MEA53100 | Microscope setup |
| 10X Plan Fluor Ph1 objective 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Microscope setup |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | Sola light engine | Microscope setup |
| Fluorescence filter set | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Microscope setup |
| Orca Flash 4.0 V2 Camera | Hamamatsu | 77054098 | Microscope setup |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Software for image analysis |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Software for image analysis |
| Orbital shaker incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Platform shaker | Fisher | 13-687-700 | For growth of amoebae at 22 °C |
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Undercounter refrigerated incubator | Fisher | 97990E | For growth of amoebae at 22 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
References
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
- Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
- Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
- Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
- Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
- Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
- Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
- Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
- Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
- Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
- Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, 58 (1990).
- Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -. P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
- Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
- Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
- Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
- Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
- Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
- Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
- Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
- O’Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).
