小鼠原位转移性乳腺癌模型的建立及小鼠根治性乳房切除术

Summary

我们介绍了小鼠原位乳腺癌模型和根治性乳房切除术模型与生物发光技术, 以量化肿瘤负担, 以模拟人类乳腺癌的进展。

Abstract

在体内小鼠模型, 以评估乳腺癌进展是必不可少的癌症研究, 包括临床前的药物开发。然而, 大多数的实际和技术细节通常被省略在出版的手稿, 因此, 这使得它的挑战, 重现模型, 特别是当它涉及手术技术。生物发光技术允许评估少量的癌细胞, 即使在肿瘤无法感觉到的情况下也是如此。利用荧光素酶表达癌细胞, 我们建立了一个乳腺癌原位接种技术具有较高的肿瘤发生率。肺转移是通过体外技术评估的。然后, 我们建立了一个低局部复发率的乳房切除术模型, 以评估转移性肿瘤负担。本文分别详细介绍了肿瘤发生率高、局部复发率低的乳腺癌原位植入术和乳房切除术的手术技术, 以提高乳腺癌模型的效率。

Introduction

动物模型在癌症研究中发挥着关键作用。当一个假设在体外得到证实时, 应该在体内进行测试, 以评估其临床相关性。与体外模型相比, 动物模型往往更好地捕获癌症进展和转移, 在动物模型中测试一种新药作为药物开发^的临床前研究 1^{, 2 是}至关重要的。然而, 动物实验的技术细节往往在发表的文章中没有得到很好的描述, 因此很难成功地复制这个模型。事实上, 建立这些原位接种和乳房切除术模型的作者经历了漫长而严格的试验和错误过程。癌细胞接种后肿瘤发生的成功率是决定动物研究成功和效率的关键因素之一.小鼠的细胞系和接种细胞数量、接种部位和菌株都是重要因素。众所周知, 与体外技术相比, 由于个体差异, 动物实验的结果有巨大的差异。因此, 使用具有标准技术的成熟模型对于获得稳定的结果、提高动物实验的效率、避免误导结果具有重要意义。

本文为建立乳腺癌原位切除术和乳房切除术小鼠模型提供了完善的技术。这些方法的目的是: 1) 模仿人类乳腺癌的进展和治疗课程, 2) 进行体内实验, 与其他乳腺癌接种或乳房切除术技术相比, 效率更高, 成功率更高。在原位癌细胞接种中, 为了模仿人类乳腺癌的进展, 我们选择 #2 乳腺脂肪垫作为接种部位, 位于胸部。在大多数研究中, 乳腺癌细胞是皮下注射 5.这种技术不需要手术, 因此, 它是简单和直接的。然而, 皮下微环境与乳腺微环境有很大的不同, 导致不同的癌症进展, 甚至分子谱^6,7。一些研究使用位于腹部的乳腺 #4 作为接种部位⁶。然而, 由于 #4 乳腺位于腹部, 最常见的转移模式是腹膜癌^{病 7}, 它发生与少于10% 的转移性乳腺癌⁸。乳腺癌所产生的技术, 在 #2 乳腺, 转移到肺, 这是最常见的乳腺癌转移部位^之一9。

与其他乳腺癌接种技术相比, 与其他乳腺癌接种技术相比, 该技术的目标也是实现更高的肿瘤发生率, 肿瘤大小变异性最小。为此, 在胶质蛋白质混合物中悬浮的癌细胞通过胸壁前半切口在直视下接种。与皮下或非手术注射相比, 这种技术产生了较高的肿瘤发生率, 肿瘤大小和形状的变异性较小, 如先前报道^{的 3,7}。

我们还介绍了一种小鼠根治性乳房切除术技术, 其中原位乳腺肿瘤切除与周围的组织和腋窝淋巴结。在临床环境中, 无远处转移疾病乳腺癌患者的护理标准是乳房切除术 10^,11。在乳房切除术前, 通过影像学和前哨淋巴结活检测量腋窝淋巴结转移。如果没有腋窝淋巴结转移的证据, 病人则接受全或部分乳房切除术, 其中省略腋窝淋巴结切除术。全乳房切除术是一种将乳腺癌切除为整体的技术, 而部分乳房切除术则是以周围正常乳房组织的边缘切除乳腺癌, 从而保存乳房内剩余的正常乳房组织。病人。然而, 在乳房部分切除术后保持剩余正常乳房组织的患者需要术后放疗^,以避免局部复发10。腋窝淋巴结转移的患者进行根治性乳房切除术, 切除乳腺癌, 所有正常的乳房组织和腋窝淋巴结, 并侵入组织^{共 10,11}。在小鼠模型中, 对腋窝淋巴结转移和/或术后辐射的监测是不合理或不可行的。因此, 我们利用根治性乳房切除术技术, 以避免局部或腋窝淋巴结转移。

肿瘤细胞通过尾静脉接种是最常见的肺转移小鼠型 12, 即所谓的 “实验转移”。此模型易于生成, 不需要手术;然而, 它不模仿人类乳腺癌的进展, 这可能会导致不同的转移性疾病行为。为了模仿乳房切除术后经常发生转移的人类乳腺癌治疗过程, 在原位癌细胞接种后切除原发肿瘤。与先前报道的¹³例单纯肿瘤切除相比, 这种技术产生的局部复发较少, 对新的治疗、临床前研究和转移性乳腺癌研究非常有用。这里描述的技术适用于大多数乳腺癌原位模型实验。然而, 重要的是要考虑到, 胶状蛋白混合物可以影响微环境和手术可以影响压力免疫反应 14.因此, 研究微环境和压力/免疫反应的研究人员应意识到潜在的混淆因素。

Protocol

所有实验均获得罗斯威尔公园综合癌症中心机构动物护理和使用委员会的批准。 请注意:获得了9到12周的雌性 balb1 小鼠。4t1-幸运2细胞, 一种小鼠乳腺腺癌细胞系, 来自自 balbse 小鼠, 已被设计为表达荧光素酶, 被使用。这些细胞在罗斯威尔公园纪念研究所 (rpmi) 1640 培养基中培养, 培养基中含有10% 的胎儿牛血清 (fbs)。 1. 仪器的制备 在组?…

Representative Results

原位模型的目的是模仿人类癌症的进展 (即, 原发肿瘤的生长, 其次是淋巴结转移, 然后是远处的肺转移)15。癌细胞接种后, 定期量化生物发光 (2 至 3个星期) (图 1a)。肺部的生物发光比原发性病原发病变更深、更小。生物发光主要反映活小鼠3的原发肿瘤负担 (图 1b和1B)。肿瘤…

Discussion

在过去的十年里, 我们已经建立了多种小鼠癌症模型, 包括乳腺癌模型^{3、7、13、}16^、20^、21.此前 , 我们证明 , 乳腺癌细胞在直视下对乳腺组织进行原位接种 , 产生的肿瘤比在周围注射细胞时没有手术切口 7 的肿瘤体积变化较小 ..通过…

Materials

Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture