Generazione di un modello di cancro al seno metastatico murino ortotopico ed eseguendo murino mastectomia radicale

Summary

Vi presentiamo un modello murino ortotopico di cancro del seno e mastectomia radicale modello con tecnologia di bioluminescenza per quantificare il carico del tumore per simulare la progressione del cancro al seno umano.

Abstract

Modelli di topo in vivo per valutare la progressione del cancro al seno sono essenziali per la ricerca sul cancro, compresi gli sviluppi preclinici droga. Tuttavia, la maggior parte dei dettagli pratici e tecnici comunemente è omessi nei manoscritti pubblicati che, pertanto, rende difficili da riprodurre i modelli, in particolare quando si tratta di tecniche chirurgiche. Bioluminescenza tecnologia consente la valutazione delle piccole quantità di cellule tumorali anche quando un tumore non è palpabile. Utilizzando le cellule tumorali che esprimono luciferasi, stabiliamo una tecnica di inoculazione ortotopico cancro al seno con un tasso alto tumorigenesi. Metastasi del polmone è stato concluso utilizzando una tecnica di ex vivo . Abbiamo, quindi, stabilire un modello di mastectomia con un tasso basso di ricorrenza locale per valutare l’onere di tumore metastatico. Qui, descriviamo, in dettaglio, le tecniche chirurgiche di impianto ortotopico e mastectomia per cancro al seno con un tasso di tumorigenesi alta e bassa percentuale di recidiva locale, rispettivamente, per migliorare l’efficienza del modello di cancro al seno.

Introduction

Modelli animali svolgono un ruolo chiave nella ricerca sul cancro. Quando un’ipotesi è dimostrata in vitro, devono essere testato in vivo per valutare la sua rilevanza clinica. Metastasi e progressione del cancro sono spesso meglio catturati dai modelli animali rispetto ai modelli in vitro, ed è essenziale per testare un nuovo farmaco in un modello animale come uno studio preclinico per droga sviluppo^1,2. Tuttavia, i dettagli tecnici degli esperimenti sugli animali spesso non sono ben descritti in articoli pubblicati, che lo rende difficile da riprodurre con successo il modello. Infatti, gli autori che hanno stabilito questi modelli ortotopici di inoculazione e mastectomia è attraversato da lunghi e rigorosi processi di prova ed errore. Il tasso di successo del tumorigenesis dopo l’inoculazione delle cellule di cancro è uno dei fattori chiavi per determinare il successo e l’efficienza di un animale di Studio³. La linea cellulare e il numero di celle per inoculare, il sito di inoculazione e il ceppo dei topi sono tutti fattori importanti. È noto che ci sono enormi variazioni nei risultati degli esperimenti sugli animali a causa di differenze individuali, rispetto alle tecniche in vitro. Pertanto, utilizzando un modello ben consolidato con una tecnica standard è importante per ottenere risultati stabili, per migliorare l’efficienza degli esperimenti sugli animali e per evitare risultati falsi.

Questo documento fornisce tecniche ben consolidate⁴ per generare modelli del cancro al seno orthotopic e mastectomia del mouse. Questi metodi mirano 1) per simulare la progressione del cancro al seno umano e corsi del trattamento e 2) di condurre esperimenti in vivo con una maggiore efficienza e più alti tassi di successo rispetto ad altri inoculazione di cancro al seno o tecniche di mastectomia. A inoculazione di orthotopic del cancro delle cellule, per simulare la progressione del cancro al seno umano, scegliamo il cuscinetto grasso mammario #2 come un sito di inoculazione, che si trova nel petto. Nella maggior parte degli studi, le cellule di cancro al seno sono inoculate sottocute⁵. Questa tecnica non richiede intervento chirurgico e, quindi, è semplice e diretto. Tuttavia, il microambiente sottocutaneo è abbastanza differente dal microambiente della ghiandola mammaria, che si traduce nella progressione del cancro diversi e profili molecolari anche^6,7. Alcuni studi riportano la ghiandola mammaria #4, che si trova nell’addome, come un sito di inoculazione⁶. Tuttavia, poiché #4 ghiandole mammarie sono situati nell’addome, il modello metastatico più comune è la carcinosi peritoneale⁷, che si verifica con meno del 10% di carcinoma mammario metastatico cancro⁸. Cancro al seno generato dalla tecnica ha presentata qui, nella ghiandola mammaria #2, si riproduce per metastasi al polmone, che è una delle più comuni al seno cancro metastatico siti⁹.

Con questa tecnica, l’obiettivo è anche di raggiungere un più alto tasso di tumorigenesi con variabilità di dimensione minima del tumore rispetto ad altre tecniche di inoculazione del cancro al seno. A tale scopo, le cellule tumorali sospese in una miscela di proteine gelatinoso vengono inoculate sotto visione diretta attraverso un’incisione di parete di cassa anteriore mediana. Questa tecnica produce un tasso di tumorigenesi alta con minore variabilità rispetto all’iniezione sottocutanea o non-chirurgico, come precedentemente segnalato^3,7e delle dimensioni del tumore.

Introduciamo anche una tecnica di mastectomia radicale del mouse in cui il tumore al seno ortotopico è resecato con i tessuti circostanti e i linfonodi ascellari. In ambito clinico, lo standard di cura per malati di cancro al seno senza malattia di metastasi a distanza è mastectomia^10,11. Prima di una mastectomia, metastasi di linfonodo ascellare è esaminata dalla biopsia di linfonodo di imaging e sentinella. Se non c’è nessuna evidenza di metastasi di linfonodo ascellare, il paziente viene quindi trattato con una mastectomia totale o parziale, in cui la resezione di linfonodo ascellare è omesso. Mastectomia totale è una tecnica per resecare il cancro al seno con il tessuto del seno tutto in blocco, considerando che la mastectomia parziale deve resecare il tumore al seno con un margine del circostante tessuto mammario normale solo, così conservando il tessuto restante del seno normale nella paziente. Tuttavia, i pazienti che conservano la restante tessuto normale del seno dopo una mastectomia parziale richiedono radioterapia postoperatoria per evitare la ricorrenza locale¹⁰. I pazienti che hanno metastasi di linfonodo ascellare si impegnano mastectomia radicale che rimuove il cancro al seno con normale tutti i linfonodi ascellare e del tessuto del seno e invasero tessuti en bloc^10,11. Nel modello del topo, sorveglianza per radiazioni di metastasi e/o post-operatorio di linfonodo ascellare non è ragionevole o fattibile. Quindi, utilizziamo la tecnica di mastectomia radicale per evitare la metastasi di linfonodo ascellare o locale.

Inoculazione delle cellule del cancro attraverso la vena della coda è la più comune del polmone metastasi del mouse modello¹², il cosiddetto “metastasi sperimentale”. Questo modello è facile da generare e non richiedono un intervento chirurgico; Tuttavia, esso non imitare la progressione del cancro al seno umano che può causare un comportamento diverso malattia metastatica. Al fine di simulare il ciclo di trattamento di cancro al seno umano cui metastasi si verifica spesso dopo mastectomia, il tumore primario è rimosso dopo inoculazione di orthotopic del cancro delle cellule. Questa tecnica produce meno ricorrenza locale rispetto alla resezione del tumore semplici, come precedentemente segnalato¹³ed è utile per nuove terapie, studi preclinici e per gli studi di ricerca del cancro della mammella metastatico. Le tecniche qui descritte sono applicabili per la maggior parte degli esperimenti di modello ortotopico di cancro al seno. Tuttavia, è importante considerare che la miscela di proteine gelatinoso può influenzare il microambiente e chirurgia può influenzare la risposta di stress/immunitario¹⁴. Pertanto, gli investigatori studiando il microambiente e/o la risposta di stress/immunitario dovrebbero essere informati di potenziali fattori di confondimento.

Protocol

Approvazione da parte del Comitato di uso e Roswell Park Cancer completa centro animale istituzionale Care è stata ottenuta per tutti gli esperimenti. Nota: Nove a dodici settimane-vecchi topi BALB/c femminili sono ottenuti. 4T1-luc2 cellule, una linea di cellule di adenocarcinoma mammario di topo derivata da topi BALB/c è stata studiata per esprimere luciferasi, vengono utilizzate. Queste cellule sono coltivate in mezzo 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% si…

Representative Results

Lo scopo del modello ortotopico è quello di imitare la progressione del cancro umano (cioè, la crescita del tumore primario seguita da metastasi linfonodali e metastasi del polmone quindi distanti)15. Dopo l’inoculazione delle cellule di cancro, la bioluminescenza è quantificata regolarmente (due o tre volte / settimana) (Figura 1A). La bioluminescenza nei polmoni è più profondo e più piccolo della lesione primaria. La b…

Discussion

Per l’ultimo decennio, abbiamo stabilito più modelli murini cancro, compresi seno cancro modelli^{3,7,13,16,20,21}. Precedentemente, abbiamo dimostrato che inoculazione di orthotopic seno cancro delle cellule nel tessuto della ghiandola mammaria sotto visione diretta prodotto un tumore più grande con minore variabilità di dim…

Materials

Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture