في الموقع تقنيات التهجين لعينات المرجان الكبار جزءا لا يتجزأ من البارافين
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو إجراء التهجين في الموقع على عينات المرجان الكبار التي تم تضمينها في البارافين ومقطوع على الشرائح الزجاجية. هذا أسلوب نوعية المستخدمة لتصور التعبير المكاني لإجراء تحقيق معنى المضادة الحمض النووي الريبي في الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين.
Abstract
الشعاب المرجانية هي اللافقاريات المحيطات الهامة ذات الأهمية الحاسمة للصحة العامة في المحيطات، فضلا عن صحة الإنسان. ومع ذلك، بسبب التأثيرات البشرية مثل ارتفاع درجات حرارة المحيطات وتحمض المحيطات، الشعاب المرجانية يتزايد تحت التهديد. للتصدي لهذه التحديات، أثبتت التطورات في الخلية والبيولوجيا الجزيئية أن تكون حاسمة بالنسبة لتشخيص صحة الشعاب المرجانية. تعديل بعض التقنيات التي يشيع استخدامها في الطب البشري يمكن أن تحسن كثيرا من قدرة الباحثين على علاج وحفظ الشعاب المرجانية. لمعالجة هذا الوضع، قد وضع بروتوكول التهجين في الموقع تستخدم أساسا في الطب البشري وعلم الأحياء التنموي التطوري تطويعها للاستخدام في الشعاب المرجانية الكبار تحت الضغط.
والغرض من هذا الأسلوب هو تصور التعبير المكاني لإجراء تحقيق الجيش الملكي النيبالي في أنسجة المرجان الكبار التي تم تضمينها في البارافين ومقطوع على الشرائح الزجاجية. ويركز هذا الأسلوب على إزالة البارافين والاماهه للعينة، والمعالجة الأولية للعينة لضمان نفاذية العينة، التهجين ما قبل الحضانة، التهجين لمسبار الحمض النووي الريبي، والتصور لمسبار الحمض النووي الريبي. هذا أسلوب قوية عند استخدام الكائنات الحية غير نموذجية لاكتشاف حيث يتم التعبير عن الجينات محددة، والبروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لغيرها من الكائنات غير نموذجية. ومع ذلك، يقتصر الأسلوب في ذلك فإن النوعية في المقام الأول، نظراً لكثافة التعبير يمكن أن تختلف تبعاً لمقدار الوقت المستخدمة أثناء الخطوة التصور وتركيز التحقيق. وعلاوة على ذلك، الصبر مطلوب، كما هذا البروتوكول يمكن أن تصل إلى 5 أيام (وفي كثير من الحالات، أطول) استناداً إلى أن التحقيق يجري استخدامها. وأخيراً، تلوين الخلفية غير محددة أمر شائع، ولكن يمكن التغلب على هذا القيد.
Introduction
الشعاب المرجانية منشئي النظم الإيكولوجية الحرجة والهامة للتنوع البيولوجي في المحيطات وصحة الإنسان1،،من23. أنها تتعرض للتهديد بسبب تغير المناخ وغيرها من الضغوطات البشرية المنشأ، وتعتبر العديد من الأنواع المرجانية المهددة. ومن ثم، هناك حاجة كبيرة لأدوات الخلوية والجزيئية لتشخيص الشعاب المرجانية تحت الضغط. أيضا، هناك القليل من المعلوم حول حيث يتم التعبير عن الجينات داخل أنسجة المرجان الكبار، وذلك القليل فهم وظائف هذه الجينات. لمعالجة هذه المسألة، ونحن قد تكيفت في الموقع التهجين (العش) البروتوكول، يشيع استخدامها في الطب البشري وعلم الأحياء التنموي التطوري، لاستخدامها في عينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين المرجان الكبار. هذا الأسلوب أقوى عندما تستخدم على الشعاب المرجانية الكبار التي شهدت حدثاً ضاغطة مثل التعرض للإجهاد الحراري. ومع ذلك، هذا الأسلوب يمكن استخدامها على مجموعة واسعة من الأنسجة ومراحل الحياة في الشعاب المرجانية ولا يقتصر على فقط أكد الحرارة المرجان4،،من67. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب في أنسجة أو خلايا من أي تواليات طالما هناك كدنا تسلسل المعلومات المتاحة.
والغرض من هذا الأسلوب هو تصور تحقيقات الجيش الملكي النيبالي داخل أنسجة المرجان الكبار التي تم الحفاظ عليها وجزءاً لا يتجزأ من البارافين ومقطوع على الشرائح. هذا الأسلوب هو أداة تشخيصية قوية تسمح لتصور الأحماض النووية داخل أنسجة المرجان الكبار. وقد وضعت في البداية هذا الأسلوب للتشخيص الطبي، ومنذ ذلك الحين أصبح أداة شعبية في مجالات مثل علم الأحياء التنموي وعلم الأحياء التنموي التطوري8،،من910. ايش أيضا طريقة حاسمة، لا سيما في نظم غير نموذجية، عندما الجينوم وترانسكريبتوميك تسلسل البيانات متوفرة ولكن أنماط التعبير الجيني المكاني غير معروفة. للحصول على عمل التشخيص في نظم غير نموذجية، هذا الأسلوب قوية نظراً لأنه يمكن الإشارة إلى الخلايا والأنسجة التي التعبير عن جين للفائدة، ويمكن أن يؤدي إلى أكثر النهج العلاجية المستهدفة8،،من910، 11،12. وأخيراً، أن هذا الأسلوب النوعية وأكثر قوة عندما يقترن مع البيانات التعبير الجيني الكمي11.
النهج المبين في هذه الورقة سوف تكون ذات فائدة للباحثين الذين يستطيعون مصممة بالفعل ديجوكسيجينين (حفر)-المسمى مسبار الحمض النووي الريبي (مجسات الإحساس وأنتيسينسي على السواء)، وهي الآن جاهزة لأداء التهجين في الموقع للتحقيقات بعينه. لتنفيذ هذا الأسلوب، سوف يلزم قسمين المسلسل من الأنسجة البارافين الشعاب المرجانية لكل التحقيقات التي يجري اختبارها. سيتم استخدام مقطع واحد للتحقيق المعني وأخرى للتحقيق العقاقير. التحقيق المعني سيكون عنصر تحكم للإشارة إلى الربط غير محددة. إذا تلطيخ الملاحظ في الإحساس بالتحقيق، ثم التحقيق العقاقير ليست محددة للجيش الملكي النيبالي للفائدة. يمكن تصميم المجسات للجينات أي أعرب. تستخدم العديد من الأمثلة في هذا البروتوكول، التي تم العثور عليها قبل أن يتم التعبير عنها من خلال الإجهاد الحراري في الشعاب المرجانية: فبج osteosarcoma مورين السرطاني الفيروسية هومولوج ب (المنحدر-ب)، البروتين المنشط (AP1)، وعامل نخر الورم مستقبلات 41 (41 تنفر)11. ايش استخدام المسابير المسمى حفر الجيش الملكي النيبالي المفضل على مدى استخدام المجسات الإشعاعية سبب تعاملها كثير أكثر أماناً من10. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هي حساسة للغاية ويمكن أن يؤديها على طائفة واسعة من الأنسجة والأجنة خارج الشعاب المرجانية الكبار أكد الحرارة13،14،،من1516.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد تم تعديل الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول من الأعمال السابقة في البحوث الطبية والتطوري التنموي8،9،10،،من1217. هذا البروتوكول يركز على الفروق الدقيقة في التهجين في الموقع مع تحقيق معنى المضا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل بجائزة لا. أوس-1323652 من خلال no.1012629 “الوطنية علوم المحيطات العلم ما بعد الدكتوراه زمالة مؤسسة” وجائزة من “مؤسسة ويلكوم بوروز برنامج تخصيب صندوق ما بعد الدكتوراه”.
Materials
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria – ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- Darby, I. A., Hewitson, T. D. . In situ hybridization protocols. , (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization. , (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
