Situ Parafin gömülü yetişkin mercan örnekleri için hibridizasyon teknikleri
Summary
Bu iletişim kuralı, parafin içinde gömülü ve cam slaytlar kesitli yetişkin mercan örnekleri in situ hibridizasyon gerçekleştirileceği hedeftir. Bu bir RNA Anti-anlamda prob dokulara parafin katıştırılmış uzamsal ifade görselleştirmek için kullanılan bir nitel yöntemidir.
Abstract
Mercan genel okyanus sağlığı hem de insan sağlığı için önemlidir önemli okyanus omurgasızlar vardır. Ancak, yükselen okyanus sıcaklıklar ve okyanus asitleştirme gibi insan etkileri nedeniyle, mercan giderek tehdit altında vardır. Bu sorunları çözmek için hücre ve moleküler biyoloji gelişmeler mercan sağlık tanılamak için çok önemli olduğu kanıtlanmıştır. İnsan tıpta çok kullanılan tekniklerden bazıları değiştirme tedavi ve mercan kaydetmek için araştırmacıların yeteneği büyük ölçüde artırabilirsiniz. Bu sorunu çözmek için öncelikle insan tıp ve evrimsel gelişim biyolojisi kullanılan in situ hibridizasyon için bir protokol yetişkin mercan stres altında kullanmak için adapte edilmiştir.
Bu yöntemin amacı bir RNA sondayı parafin içinde gömülü ve cam slaytlar kesitli yetişkin mercan doku içine kayma ifade görselleştirmek etmektir. Bu yöntem parafin ve rehydration örnek kaldırma, ön örnek, öncesi hibridizasyon kuluçka, RNA sonda hibridizasyon ve RNA sonda görselleştirme geçirgenliği sağlamak için örnek üzerinde odaklanır. Sigara model organizmalar nerede belirli genlerin ifade edilir ve protokol diğer sigara model organizmalar için kolayca adapte edilebilir keşfetmek için kullanırken bu güçlü bir yöntemdir. Öncelikle nitel, çünkü ifade yoğunluğu görselleştirme adım ve sonda konsantrasyonu sırasında harcanan zamanı miktarına bağlı olarak değişebilir ancak, yöntem sınırlı olmamasıdır. Bu iletişim kuralı-ebilmek almak ilâ 5 gün (ve birçok durumda daha uzun) kullanılan sonda bağlı olarak Ayrıca, sabır, gerekmemektedir. Son olarak, non-spesifik arka plan boyama yaygındır, ama bu sınırlamanın üstesinden gelebilir.
Introduction
Mercan çoğu kritik ekosistem inşaatçılar ve okyanus ve insan sağlığı1,2,3‘ te biyoçeşitlilik için önemli. İklim değişikliği ve diğer antropojenik stres nedeniyle tehdit altında olduklarını ve birçok mercan türünün kritik tehlike altında olarak kabul edilir. Böylece, mercan stres altında tanılamak hücresel ve moleküler araçları için önemli bir ihtiyaç vardır. Ayrıca, orada az nerede genler yetişkin mercan doku ve bu genlerin fonksiyonları bu nedenle küçük anlayışı içinde ifade edilir hakkında anlaşılmaktadır. Bu sorunu gidermek için sık kullanılan insan tıp ve evrimsel gelişim biyolojisi, parafin gömülü doku örnekleri yetişkin mercanlar üzerinde kullanım için in situ hibridizasyon (ISH) protokolü adapte olması. Isı stres maruz gibi stresli bir olay geçiren yetişkin mercanlar üzerinde kullanıldığında en güçlü bir tekniktir. Ancak, bu teknik çok çeşitli doku ve mercan hayat aşamalarında kullanılan ve sadece ısı vurguladı mercan4,6,7için sınırlı değildir. Ayrıca, orada olduğu sürece cDNA sırası bilgi kullanılabilir Bu teknik dokular veya herhangi bir metazoan hücreleri üzerinde kullanılabilir.
Bu yöntemin amacı RNA probları yetişkin mercan doku korunmuş ve parafin içinde gömülü ve slaytlar kesitli içinde görselleştirmek etmektir. Bu yöntem, nükleik asitler yetişkin mercan doku içinde görselleştirme sağlar güçlü bir tanı aracıdır. Başlangıçta bu yöntem tıbbi teşhis için geliştirilmiş ve beri alanlarda gelişim biyolojisi ve evrimsel gelişim biyolojisi8,9,10gibi popüler bir araç haline gelmiştir. ISH da kritik, özellikle sigara modeli sistemlerinde, genomik zaman yöntemidir ve transcriptomic sıra veri mevcut ancak kayma gen ifade desenleri bilinmemektedir. Hangi hücre ve dokuların bir gen ilgi hızlı ve daha fazla hedefli tedavi yaklaşımları8,9,10‘ aaçabilir belirtebilirsiniz tanılama iş için model olmayan sistemlerde, bu teknik güçlü çünkü, 11,12. Son olarak, bu teknik nitel ve nicel gen ifadesi verileri11ile eşleştirilmiş durumdayken daha güçlü olur.
Bu makalede özetlenen yaklaşım zaten bir digoxigenin (kazmak) tasarladık araştırmacılar için ilgi olacaktır-RNA sonda (anlam ve antisens probları) ve are şimdi bir örnek probları in situ hibridizasyon gerçekleştirmek için hazır etiketli. Bu yöntemi gerçekleştirmek için iki seri bölümler parafin mercan doku test edilen her sonda için gerekli olacaktır. Bir bölümü anlamda sonda diğeri antianlamlı sonda kullanılacaktır. Anlamda sonda non-spesifik bağlama belirtmek için bir kontrol olacak. Boyama anlamda soruşturma görülmektedir, faiz RNA için belirli antianlamlı sonda tek değil. Probları ifade herhangi bir gen için tasarlanabilir. Bu protokol için birkaç örnek daha önce mercan ısı stres sırasında ifade edilecek bulunan kullanılmıştır: FBJ fare osteosarkom viral onkogen homolog B (Fos-B), aktivatör protein (AP1) ve tümör nekroz faktör reseptör 41 (TNFR 41)11. KAZMAK etiketli RNA problar kullanarak ISH kullandıklarında daha fazla daha güvenli10olduğundan radyoaktif problar kullanarak üzerinden tercih edilir. Buna ek olarak, bu teknik son derece hassas ve çok çeşitli doku ve ısı vurguladı yetişkin mercan13,14,15,16ötesinde embriyo üzerinde gerçekleştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol için açıklanan yöntemi tıbbi ve evrimsel gelişim araştırma8,9,10,12,17önceki işten değiştirildi. Bu iletişim kuralı bir in situ hibridizasyon nüansları korunmuş ve parafin içinde gömülü yetişkin mercanlar üzerinde kazmak etiketli RNA Anti-anlamda sonda ile odaklanır. Bu yöntem ayrıca parafin gömülü olan mercan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ödülü tarafından finanse edildi yok. OCE-1323652 Ulusal Bilim Vakfı okyanus bilimi doktora sonrası Bursu ve Ödülü no.1012629 Burroughs Wellcome Fonu doktora sonrası zenginleştirme programı aracılığıyla.
Materials
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria – ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- Darby, I. A., Hewitson, T. D. . In situ hybridization protocols. , (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization. , (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
