In Vitro Allevamento di api solitarie: uno strumento per valutare i fattori di rischio larvale
Summary
Spray di fungicida per le piante di fioritura può esporre API solitarie ad alte concentrazioni di residui a carico di polline fungicida. Utilizzando esperimenti di laboratorio che coinvolgono in vitro-larve di ape allevati, questo studio indaga gli effetti interattivi di consumo fungicida-trattati polline derivato da piante ospite e non host.
Abstract
Anche se le api solitarie forniscono servizi di impollinazione cruciale per le colture selvagge e gestite, questo gruppo di specie-ricco è stato ampiamente trascurato negli studi di regolamento dei pesticidi. Il rischio di esposizione ai residui di fungicidi rischia di essere particolarmente elevato se lo spray si verifica su o in prossimità di piante ospiti mentre le api stanno raccogliendo polline per predisporre i loro nidi. Per specie di Osmia che consumano il polline da un selezionato gruppo di piante (oligolecty), l’impossibilità di utilizzare il polline di piante non host possa aumentare il loro fattore di rischio per la tossicità correlata al fungicida. Questo manoscritto descrive protocolli utilizzati per la posteriore con successo oligolectic mason API, lato di sensu di Osmia ribifloris , dall’uovo alla fase di prepupa all’interno di piastre per colture cellulari in condizioni di laboratorio standardizzati. Lo in vitro-api allevate sono successivamente utilizzate per studiare gli effetti della fonte di esposizione e polline di fungicida su fitness ape. Basato su un disegno fattoriale 2 × 2 completamente attraversato, l’esperimento esamina gli effetti principali e interattivi della fonte di esposizione e polline di fungicida su fitness larvale, quantificata dalla biomassa prepupa, tempo dello sviluppo larvale e sopravvivenza. Dei principali vantaggi di questa tecnica è che utilizzando in vitro-api allevate riduce la variabilità del fondo naturale e consente la modifica simultanea di più parametri sperimentali. Il protocollo descritto presenta uno strumento versatile per ipotesi test che coinvolgono la suite di fattori che incidono sulla salute delle API. Per gli sforzi di conservazione essere accolti con successo significativo, duraturo, tali intuizioni la complessa interazione di fattori fisiologici ed ambientali ape declini di guida si rivelerà per essere critici.
Introduction
Dato il loro ruolo come gruppo dominante degli insetti impollinatori1, la perdita globale delle popolazioni di API rappresenta una minaccia per la sicurezza alimentare ed ecosistema stabilità2,3,4,5,6 ,7. Le tendenze in declino in entrambe le popolazioni di API gestite e selvatici sono state attribuite a diversi fattori di rischio condivisi tra cui frammentazione degli habitat, emergendo parassiti e agenti patogeni, perdita di diversità genetica e l’introduzione di specie invasive3 ,4,7,8,9,10,11,12. In particolare, l’aumento drammatico nell’uso di pesticidi, (ad es., neonicotinoidi) è stato collegato direttamente agli effetti nocivi tra API13,14,15. Parecchi studi hanno indicato che il sinergismo tra neonicotinoidi e d’inibizione biosintesi dell’ergosterolo fungicidi (EBI) può condurre ad alta mortalità attraverso multiple ape specie16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. Tuttavia, fungicidi, a lungo considerati essere ‘bee-safe’, continuano a essere spruzzato sulle colture in fiore senza molto controllo23. Api bottinatrici sono state documentate per riportare ordinariamente carichi di polline contaminati con fungicida residui24,25,26. Il consumo di tali fungicida-ladenpollen può causare elevata mortalità larvale API27,28,29,30e una suite di effetti sub-letali tra API adulte16 , 31 , 32 , 33 , 34. uno studio recente suggerisce che i fungicidi possono causare perdite di API alterando la comunità microbica all’interno alveare-memorizzati polline, quindi interrompere i critici simbiosi tra API e polline-sopportate microbi35.
Sebbene le api solitarie sono vitali per l’impollinazione di varie piante selvatiche e agricoli36,37,38, questo gruppo eterogeneo di impollinatori ha ricevuto molta meno attenzione a studi di monitoraggio dei pesticidi. Il nido di una femmina adulta solitaria contiene 5-10 camere coulors stagne, ciascuno fornito di una massa finita di maternamente raccolti di polline e nettare e un singolo uovo39. Dopo la schiusa, le larve si affidano la fornitura di polline allocata e il microbiota associato a carico di polline per ottenere un’adeguata nutrizione40,41. Perché mancano i vantaggi di uno stile di vita sociale, le api solitarie possono essere più vulnerabili a pesticidi esposizione42. Per esempio, mentre i deficit sociali delle API seguendo uno spray possono essere compensati per estendere alcune dai lavoratori ed emergenti Covata, la morte di una donna solitaria adulta sola termina tutte le attività riproduttiva43. Tali differenze nella suscettibilità evidenziano la necessità di incorporare taxa diversi ape in studi ecotossicologici per garantire una protezione adeguata per le API gestite e selvagge allo stesso modo. Tuttavia, a parte una manciata di studi, indagini sugli effetti dell’esposizione di fungicida ha focalizzato il sociale API18,23,32,44,45 ,46,47,48,49.
Le api solitarie, appartenenti al genere Osmia (Figura 1) sono state utilizzate in tutto il mondo come impollinatori efficienti di diversi importanti frutta e dado colture39,50,51,53, 53. come con altri impollinatori gestito gruppi24,54,55,56,57,58, api adulte Osmia sono ordinariamente esposti ai fungicidi spruzzati sulle colture in fiore44. Le femmine adulte foraggiamento sulle colture recentemente spruzzati possono raccogliere e stock loro nidiata chambers con fungicida-carichi di polline, che più tardi forma la dieta esclusiva per lo sviluppo larve. Consumando le disposizioni di polline contaminati possa esporre successivamente alle larve di fungicida residui42. Il rischio di esposizione può essere maggiore tra oligolectic specie che si nutrono solo a pochi host strettamente correlate piante59,60,61. Alcuni megachilid API, ad esempio, sembrano preferenzialmente foraggio per polline Asteraceae di bassa qualità, come un mezzo per ridurre il parassitismo62. Tuttavia, nella misura in cui fungicidi impatto larvale fitness tra api solitarie oligolectic empiricamente non è stata quantificata. L’obiettivo di questo studio è di sviluppare un protocollo per testare i principali e gli effetti interattivi della fonte di esposizione e polline di fungicida sull’idoneità in vitro allevati api solitarie. Per studiare, uova di lato di sensu di o. ribifloris (s.l.) possono essere ottenute in commercio (tabella materiali). Questa popolazione è ideale per la sua importanza come un impollinatore nativo e la sua forte predilezione per i ricchi di nettare Mahonia aquifolium (Oregon grape) trovati all’interno della regione53,63,64 (Figura 2).
Figura 1. Una foto ad alta risoluzione di un adulto Osmia ribifloris. Foto credit Dr. Jim Cane, ricerca entomologo, USDA-ARS Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Nidificazione di canne di Osmia ribifloris (s.l.) con una femmina di nidificazione in primo piano. Phragmite Camera partizioni e terminali di chiusura per le ance sono costruiti da masticated foglie. Foto di credito signor Kimball Clark, NativeBees.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il primo obiettivo di questo studio è di valutare l’effetto del consumo di polline fungicida-trattati sulla forma larvale (misurata in termini di tempi di sviluppo e prepupa biomassa). Mentre l’esposizione per il propiconazolo fungicida comunemente applicata è stato collegato alla mortalità aumentata tra API adulte attraverso diverse specie 23,24,32,44,45, 54,55,56,57,58,65,66,67, l’impatto sulle API larvale è minore noto. Il secondo obiettivo di questo studio è di valutare gli effetti del consumo di polline non host su fitness larvale. Gli studi precedenti indicano che le larve delle API oligolectic non riescono a svilupparsi quando costretti a consumare polline non host68. Tali risultati possono essere attribuiti alle variazioni di ape fisiologia69, polline biochimica70e il microbioma beneficio associati con polline naturale disposizioni71. Il terzo obiettivo di questo studio è di valutare gli effetti interattivi di trattamento fungicida e polline dietetico su fitness larvale.
Numerosi tratti biologici tra cui dimensione corporea materna, provisioning di tasso, strategia di foraggiamento e polline quantità72,73,74,75 sono noti per influenzare larvale fitness tra le api solitarie. Questi fattori possono introdurre variabilità significativa tra canneti, che pone una sfida nello sviluppo di disegni sperimentali difendibile nel valutare salute larvale. Inoltre, dato che lo sviluppo larvale si verifica all’interno di ance nidificazione sigillati, gli effetti di tale variabilità sulla progenie sono difficili da visualizzare e quantificati senza l’utilizzo di tecniche non letali (Figura 3). Per superare questa sfida, tutte le ipotesi all’interno di questo studio sono testate utilizzando larve allevate di fuori della loro nidificazione ance. Il disegno sperimentale rappresenta un completamente attraversato 2 × 2 fattoriale set-up, con ciascun fattore composto da 2 livelli; Fattore 1: Esposizione fungicida (fungicida; Nessun fungicida); Fattore 2: Fonte di polline (Host polline, polline Non-host). Le API vengono generate dall’uovo alla fase di prepupa all’interno di piastre per colture cellulari del multiwell sterile sotto condizioni di laboratorio controllate. Ognuno ben individualmente è fornito con una quantità standardizzata di fornitura di polline e un singolo uovo. Dopo la schiusa, la larva si nutre di polline allocato all’interno del pozzo, completa lo sviluppo larvale e avvia impupamento. Studi precedenti hanno mostrato che la mortalità non spiegata è più bassa tra le API generate all’interno di questo ambiente di allevamento artificiale rispetto a quello rilevato nel selvaggio49,76. L’uso di in vitro-api allevate presenta parecchi vantaggi sopra gli studi sul campo: 1) riduce al minimo gli effetti confondenti di variabilità naturale e incontrollati fattori connessi tipicamente con gli studi sul campo; 2) permette più livelli di manipolazione per ogni fattore di interesse per essere testate contemporaneamente tra gruppi di trattamento; 3) il numero delle ripetizioni può essere predeterminato, e fattori sperimentali per ogni replica possono essere manipolati individualmente; 4) variabili di risposta larvale possono essere facilmente visualizzate e registrate in modo indipendente senza inquietante larve adiacenti; 5) il protocollo può essere modificato per ospitare disegni sperimentali più complessi che coinvolgono molteplici fattori e variabili di risposta.
Figura 3. Contenuto all’interno di una canna di nidificazione naturale di Osmia ribifloris (s.l.). Chiuda in su (A) una canna dissecata mostrando singole camere, disposizioni di polline e partizioni e (B) appena raccolto polline disposizioni e le uova associate (indicate con un cerchio nero). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Allevamento di API fuori loro canne nidificazione naturale, in condizioni di laboratorio, permette il testing di molteplici ipotesi relative al fitness larvale. Nella misura in cui non identificati fattori continuano a causare mortalità delle API, studi di valutazione del rischio utilizzando in vitro esperimenti possono aiutare identificare potenziali minacce e informare le pratiche di gestione per questo gruppo di specie-ricco degli impollinatori selvatici 12 ,<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Kimball Clark e Tim Krogh per fornire Osmia nidificazione ance, Meredith Nesbitt e Molly Bidwell per assistenza in laboratorio, d. ssa Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter e tre utenti anonimi per loro osservazioni utili che il manoscritto è migliorato. Questo lavoro è stato sostenuto USDA-Agricultural Research Service appropriato (attuale ricerca Information System #3655-21220-001), Wisconsin Dipartimento dell’agricoltura, commercio e tutela dei consumatori (#197199), National Science Foundation (sotto Grant No. DEB-1442148), il DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (ufficio DOE di scienza BER DE-FC02-07ER64494).
Materials
| eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) | Kaysville, Davis County, Utah, USA | ||
| Osmia reeds | Nativebees.com | NA | Freshly plugged reeds |
| Dissection set | VWR | 89259-964 | Sterilize before use |
| Long Nose Pliers | Husky | 1006 | |
| 6 well culture plates | VWR | 10062-892 | Sterile sealed |
| 48 well culture plates | VWR | 10062-898 | Sterile sealed |
| Petri dishes | VWR | 25373100 | Sterile sealed |
| Square Weighing Boats | VWR | 10770-448 | |
| Camel Hair Brush | Bioquip | 1153A | |
| Tin capsules | EA Consumables | D1021 | Sterilize before use |
| Sucrose | VWR | 470302-808 | |
| Propiconazole 14.3 | Quali-Ppro | 60207-90-1 | Propiconazole 14.3% |
| Honey bee pollen | Bee energised | 897098001244 | Untreated, natural, raw pollen |
| Microbalance | VWR | 10204-990 | |
| Pulverisette | LAB SYNERGY INC. | 30334913 | |
| Wooden sticks | VWR | 470146908 | Sterilize before use |
| Sealing tape | VWR | 89097-912 | |
| Microscope | VWR | 89403-384 | |
| Planting tray | VWR | 470150-632 | |
| Ethanol | VWR | BDH1158-4LP | |
| Centrifuge tube | VWR | 21008936 | |
| Microsyringe | Cole-Palmer | UX-07940-07 | |
| Rubber tweezer | Amazon | B0135HWPN4 | |
| Syringe needles | VWR | 89219-334 | |
| Freeze drier | Labcono | LFZ-1L | |
| Statistical software | SPSS | Version 21.0 |
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