En bioluminescerende bakterier regulere lys produktion gennem en række mekanismer, såsom quorum sensing. Denne nye metode tillader i situ -undersøgelse af bioluminescens og sammenhængen af lys emission til celle tæthed. En kunstig en bioluminescerende Escherichia coli system tillader karakterisering af lux operonmodifikation, Lux proteiner og deres samspil.
Der er et betydeligt antal bakteriearter kan udsende lys. Alle af dem deler samme gen klyngen, nemlig lux operon. Trods denne lighed viser disse bakterier ekstreme variationer i karakteristika såsom vækst opførsel, intensiteten af lys emission eller regulering af bioluminescens. Den metode, der præsenteres her er en nyudviklet assay, der kombinerer optagelse af cellevækst og en bioluminescerende lysudsendelse intensitet over tid udnytter en pladelæseren. Den deraf følgende vækst og lysudsendelse egenskaber kan være knyttet til vigtige funktioner i de respektive bakteriel stamme, såsom quorum sensing forordning. Dyrkning af en vifte af en bioluminescerende bakterier kræver et specifikt medium (f.eks, kunstige havet vand medium) og defineret temperaturer. Det let at håndtere, ikke en bioluminescerende standard-forskning bakterien Escherichia coli (E. coli), på den anden side kan dyrkes billigt i store mængder i laboratoriet skala. At udnytte E. coli ved at indføre et plasmid som indeholder den hele lux operon kan forenkle forsøgsbetingelser og åbner desuden mange muligheder for fremtidige ansøgninger. Udtryk for alle lux gener udnytter en E. coli udtryk stamme blev opnået ved opførelsen af et udtryk plasmid via Gibson kloning og indsættelse af fire fragmenter der indeholder syv lux gener og tre ribben gener af lux-rib operon i en pET28a vektor. E. coli baseret lux genekspression kan induceret og styres via Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Desuden resulterer i en bioluminescerende E. coli celler. Fordele ved dette system er at undgå quorum sensing forordning restriktioner og komplekse medium kompositioner sammen med ikke-standardiserede vækstbetingelser, som er defineret temperaturer. Dette system giver mulighed for analyse af lux gener og deres samspil med udelukkelse af den respektive gen fra lux operonen, eller endda tilføjelse af nye gener, udveksle luxAB generne fra en bakteriel stamme af en anden, eller analysere proteinkomplekser, såsom luxCDE.
Emission af lys af levende organismer (bioluminescens) er en fascinerende proces findes i bakterier, svampe, insekter, nematoder, fisk og blæksprutter1. En bioluminescerende lysudsendelse fremgår af kemiluminescerende reaktion, hvor kemisk energi omdannes (delvist) til lys energi (“kolde lys”). I en bioluminescerende bakterier katalyserer heterodimerisk enzymet luciferase monooxygenation af langkædede, alifatiske aldehyder, såsom tetradecanal, til de tilsvarende syrer ledsaget af lys emission med et maksimum på 490 nm2, 3.
Figur 1 : Generelle reaktion ordning af bakteriel luciferase. Den bakterielle luciferase (LuxAB) katalyserer monooxygenation af langkædede aldehyder (CH3(CH2)nCHO) ved at udnytte reduceret flavin mononucleotide (FMNH2) og molekylær ilt (O2), fremstilling af produkter lang kæde syrer (CH3(CH2)nCOOH), flavin mononucleotide (FMN), vand (H2O), og emissionen af lys centreret på 490 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Den energi, der frigives under denne oxidation medfører en eksiteret tilstand FMN-4a-hydroxid, der tjener som lysemitterende luciferin4. Proteiner involveret i bakteriel bioluminescens, nemlig LuxCDABEG, er kodet af lux operon og er meget bevaret over forskellige bakteriestammer2,5. Gener luxA og luxB indkode for heterodimerisk luciferase; Luxc’s, Luxd’sog Luxe’s genprodukter er komponenter af en fedtsyre reduktase kompleks; og luxG koder for en flavin reduktase6. En række af en bioluminescerende Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) bære yderligere luxF genet. Det blev rapporteret, at LuxF er et homodimeriske protein, der binder den usædvanlige flavin derivat 6-(3′-(R)-myristyl)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Yderligere gener er blevet identificeret som er ansvarlig for riboflavin syntese (fx ribEBH) og desuden regulerings gener er blevet rapporteret, at spille en rolle i quorum sensing regulering af bioluminescens, især for Vibrio fischeri og Vibrio harveyi6,13. Trods den yderst velbevarede gen rækkefølge viser en bioluminescerende bakterier høj variationer i karakteristika såsom vækst opførsel, intensiteten af lys emission eller regulering af bioluminescens2,5,14 .
Flere modificerede stammer eller plasmider, der indeholder dele eller hele lux operonmodifikation er kendt, at udnytte bioluminescens som reporter systemer. Forskellige applikationer såsom fastsættelse af promotor aktivitet, overvågning af bakterielle forureninger i miljøet eller fødevareprøver, bioluminescens resonans energi overføre (BRET), i vivo billeddannelse af infektioner i Eukaryote organismer, pyrosequencing, og så videre blev etableret15,16,17. Interessant, anvendte tre mest hyppigt en bioluminescerende reporter systemer er afledt af den nordamerikanske firefly (Photinus halvmøl), nematoder (Photorhabdus luminescens) enterisk patogenet og havet Stedmoderblomst (Renilla reniformis). Ingen af disse systemer har en bakteriel oprindelse, men brugen af lux gener og operonmodifikation fra bakteriel oprindelse er ved at vinde mere interesse for anvendt forskning16. Mindre rigelige anvendelsen af bioluminescens proteiner fra bakteriel kilder skyldes hovedsageligt lavere stabilitet og holdbarhed af bakterier stammer selvlysende proteiner, som kan være relateret til deres marine habitater. En bioluminescerende bakterier af marine habitater er ikke dyrkbare standard lab betingelser. Disse bakterier kræver specifikke vækst medier og betingelser, såsom kunstige havet vand medium og lavere vækst/inkubation temperaturer (f.eks. 28 ° C).
For at forenkle sammenligning af lux operon karakteristika eller enkelt lux gener af en række forskellige en bioluminescerende bakteriestammer, en metode til at standardisere lux operon udtryk og analyse er en forudsætning. Således opstået idéen om at integrere hele lux-rib operon i standard-forskning bakterien Escherichia coli (E. coli). Til dette formål, Gibson forsamling viste sig for at være et nyttigt redskab til at integrere flere lineær, overlappende fragmenter i ét udtryk vektor uden behov for specifik restriktion websteder. Denne metode er også velegnet, når DNA skær er for stor (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb operon størrelse) skal forstærkes via PCR. En lux operon kan opdeles i flere overlappende fragmenter, så samles til ét udtryk plasmid og endelig sekvensen verificeres forsamling produkt kan omdannes direkte til en passende E. coli system for højt udbytte protein udtryk18,19,20. Ud over den let at håndtere E. coli baseret lux genekspression, forblev en simpel metode kombinerer optagelse af cellevækst og en bioluminescerende lysudsendelse for at være etableret. Metoden beskrevet her tillader i situ måling og korrelation af celle tæthed og lys emission af en bioluminescerende bakterier.
Analyse af lux gener og lux operon orden og regulering af forskellige en bioluminescerende bakterier med, på den ene side, en kunstig en bioluminescerende E. coli system, der indeholder hele lux-rib operon af s. mandapamensis 27561 og på den anden side, en nyudviklet plade læser assay kombinerer in situ optagelse cell tæthed og lysudsendelse, hjælper med at få flere oplysninger om de forskellige bakterielle lux systemer. Denne grundlæggende karakterisering og sammenligning af luciferases og relaterede enzymer kan føre til alternativer til de allerede etablerede reporter systemer med øget stabilitet og aktivitet.
Opførelsen af et udtryk plasmid som indeholder fire fragmenter komponere hele lux-rib operon af P. mandapamensis 27561 blev opnået via Gibson kloning. Denne E. coli baseret lux genekspression gør det muligt for E. coli celler til at udsende lys. Undgå quorum sensing forordning og ikke-standard betalingsnumre vækstbetingelser er betydelige fordele ved dette system.
Fordelene ved at bruge Gibson kloning strategi er den nem montering af flere lineære DNA fragmenter, høj fleksibilitet og ikke behov for specifik restriktion websteder18,19,20. Denne metode gør det nemt at ændre en lux operonen, undtagen enkelt gener eller gen klynger eller at indføre nye gener eller udveksling af gener fra én stamme med en anden. En forudsætning for anvendelse af denne metode er tilgængeligheden af den respektive lux operon gensekvens. Kun til et lille antal af en bioluminescerende bakterier er den komplette DNA-sekvens af den respektive lux operon kendte og/eller tilgængelige. Mange af disse sekvenser er opsplittet, fordi de var genereret ved hjælp af shotgun sekvensering. For den undersøgte P. mandapamensis 27561 den komplette DNA-sekvens af lux operon er kendt og tilgængelig fra NCBI gen database (GenBank: DQ988878.2).
Et kritisk trin i protokollen for samlingen Gibson er beregningen af DNA koncentrationen af de enkelte fragmenter. I forsamlingen-protokollen af fabrikanten det blev anbefalet at bruge 0,2 – 0,5 pmols og en samlet maengde paa 20 µL for 4-6 fragmenter20,21. I vores tilfælde, hvor luxCDABFEG-ribEBH består af 4 fragmenter, var koncentrationer og samlede diskenheder 0,1 pmol og 45 µL, henholdsvis afhængigt af udbyttet af PCR-produkter. På den ene side fusionen måtte reduceres og på den anden side volumen skulle forhøjes. Ikke desto mindre, forsamlingen arbejdede nuvel og DNA-sekventering bekræftet den korrekte indføring i første forsøg. Denne konstatering bekræftes Gibson forsamling som en robust og hensigtsmæssig metode til vores undersøgelser, der let kan modificerede18,19,20.
Nyetableret plade læser assay er en nem at håndtere metode. Det giver mulighed for en enkelt primær analyse af nye eller (FN) kendt en bioluminescerende bakteriestammer og giver allerede en første vink om den regulerende mekanisme af lys produktion (fx halter i luminescence ved lav celle tætheder). Derudover kan vækstbetingelser i kombination med lys produktion nemt blive evalueret ved blot at ændre vækstmediet eller temperatur.
Målinger med i pladelæseren blev udført ved 28 ° C. Årsagen til denne usædvanlige indstilling er temperatur-følsomheden af en bioluminescerende bakteriestammer, hvor temperaturer over 30 ° C føre til mindre eller slet ingen vækst og/eller lysudsendelse. Bemærk, at i pladelæseren er i stand til at holde en fastlagt temperatur over tid med begrænsning af en manglende aktivt kølesystem. Den omgivende temperatur har derfor at være lavere end temperaturen i målingen.
Som en proof of concept, sammenligning af E. coli -konstruktionen med en bioluminescerende stammen P. mandapamensis (figur 5) på den ene side og referencemålinger (figur 4) på den anden side blev udført og bekræfte pålideligheden af dette nyligt etablerede system. Derudover sikres langsigtet måling levetiden af lys emission (figur 6). Men man skal overveje at OD-værdierne ikke er pålidelige over visse ekstinktionen, afhængigt af de særlige kendetegn ved den anvendte måling enhed (ca. 15 h i den foreliggende sag) hvor en passende fortynding ville være nødvendige for en måling i den lineære område af detektorens. Disse høje afvigelser i OD-værdierne gøre disse længe målinger ikke pålideligt. Derfor anbefales kortere målinger såsom 10 h ved hjælp af opsætningen af eksperimenterende rapporteret her.
Begrænsninger af etablerede plade læser analysen kan ses i figur 7. Vanskeligheden er at finde en passende indstilling af målingen. ‘Få værdi’ justerer følsomheden af foto multiplikator tube (PMT). Gevinsten er forstærkning af signal i ydelse, hvilket betyder, at en højere gain faktor vil øge signalet. Hvis gevinsten er indstillet for lavt, signal-støj-forholdet bliver større og lys intensiteter af “lav” lysende en bioluminescerende bakterier ikke kan målt nogen mere (signaler tæt på nul, data ikke vist). Udfordring i en en bioluminescerende assay er at indstille forstærkningen så måleresultaterne for alle bakteriestammer bo inden for intervallet af instrumentet. Derudover måleområdet for luminescence afhænger måling tidsinterval (f.eks. maksimalt 2.000.000 for 1 s).
Gevinsten blev sat til 2800, der empirisk blev testet og valgt for den specifikke Pladelæser bruges til oprettelse af denne metode. Indstillingen anvendes gevinst giver mulighed for optagelse af maksimalt udsendte lys af den en bioluminescerende E. coli system, P. mandapamensis 27561 og P. mandapamensis S1 uden overløb, men for stammer P. mandapamensis TH1 og V. harveyi 14126 gevinsten var for høj. Derfor, disse sidstnævnte stammer overstiger detektionsgrænsen og den reelle maksimal lysintensitet kan ikke måles. Denne tekniske begrænsninger kan forhindre sammenligning af en bioluminescerende bakterier, som viser høj variationer i maksimal lysudsendelse, selv om vækstbetingelser og celle tætheder kan være sammenlignelige.
Placering af de analyserede bakteriestammer inden for de anvendte godt plader har vurderes empirisk. Selvom sort godt plader med glas bund blev brugt, blev krydstale mellem prøverne observeret. Lysintensitet af specifikke stammer er så højt, at alle tilstødende brønde vil vise falske positive lys emissioner (fx tom). Derfor er det vigtigt at måle to forskellige stammer enten separat eller sammen med en bestemt rumlig adskillelse til hinanden.
Der er allerede mange modificerede E. coli stammer kendt som indeholder dele af lux operon og er hovedsagelig anvendelsesorienteret15,16,17. De metoder, der beskrives her, sigter mod grundforskning, for eksempel mulighed for at analysere hver lux gen separat. Forskning af bioluminescens har en lang historie, men der er stadig mange åbne spørgsmål. Udelukke eller indføre gener fra lux operon, udveksle luxAB generne med gener fra en anden stamme eller analysere protein komplekser, indlejret i den nem at håndtere E. coli system og yderligere anvendelse af pladen læser assay, kan det være muligt at få flere oplysninger om regulerende processer og funktioner af lux gener.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) for hans støtte i at etablere selv skriftlig scriptet for i pladelæseren. Dette arbejde blev støttet af østrigske “Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung” (FWF) til PM (P24189) og ph.d.-program “DK molekylære Enzymology” (W901) til PM.
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit | Promega | A9282 | for 250 rxn |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
GeneJet Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0503 | for 250 rxn |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
24-well black sensoplate with glass bottom | Greiner Bio One | 662892 | |
FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
Multitron Standard Incubator Shaker | Infors AG |