Tastatura meccanica delle cellule con pinzette ottiche senza tallone nell'embrione della drosofila
Summary
Presentiamo una configurazione di pinzette ottiche accoppiate al microscopio un foglio leggero e la sua attuazione a sonda meccanica delle cellule senza perline nell’embrione della drosofila .
Abstract
Morfogenesi richiede un coordinamento tra genetica patterning e forze meccaniche per modellare robustamente cellule e tessuti. Quindi, una sfida di comprendere processi morfogenetici è misurare direttamente le forze cellulari e proprietà meccaniche in vivo durante l’embriogenesi. Qui, presentiamo una configurazione di pinzette ottiche accoppiate al microscopio foglio leggero, che permette di applicare direttamente le forze su contatti cellula-cellula dell’embrione della drosofila precoce, mentre la formazione immagine ad una velocità di diversi fotogrammi al secondo. Questa tecnica ha il vantaggio che non richiede l’iniezione di perline in embrione, solitamente usato come sonde intermedi in cui vengono esercitate forze ottiche. Siamo in dettaglio passo dopo passo l’attuazione del programma di installazione e proporre strumenti per estrarre informazioni meccaniche dagli esperimenti. Monitorando gli spostamenti di contatti cellula-cellula in tempo reale, è possibile eseguire misure di tensione e indagare la reologia i contatti cellula.
Introduction
Lo sviluppo embrionale è un processo altamente riproducibile, durante il quale le cellule e tessuti deformano per plasmare il futuro animale. Tali deformazioni sono stati indicati per richiedere la generazione attiva delle forze al livello1,cella2. Per comprendere processi morfogenetici, durante il quale le cellule e tessuti cambiano la loro forma, pertanto è chiave per valutare le proprietà meccaniche delle cellule coinvolte e per misurare le forze all’interno del tessuto durante il processo3,4 . Strati epiteliali, soprattutto in Drosophila, ampiamente sono stati studiati a causa della loro geometria quasi-2D e alla loro manipolazione facile.
Una serie di tecniche è state così sviluppata da noi e gli altri per valutare epiteliali meccanica in vivo durante lo sviluppo. Daremo una rapida panoramica delle tre principali tecniche utilizzate in tessuti epiteliali. Ablazione laser, un metodo ampiamente utilizzato, permette di rivelare lo stress meccanico locale a cella giunzioni5,6,7,8 o a più grande scala9,10,11 eseguendo tagli locali che interrompono l’integrità meccanica del bersaglio. La dinamica di apertura dopo il taglio fornisce informazioni sull’ablazione previo lo stress sia sulla reologia del tessuto12,13. Uno svantaggio dell’ablazione laser è che è invasivo, in quanto richiede l’interruzione locale della corteccia delle cellule. Quindi, uno può eseguire solo un numero limitato di ablazioni se si vuole preservare l’integrità del tessuto. Un altro svantaggio è che ablazioni forniscono solo stime relative di tensione a contatti cellula, poiché la velocità di apertura dipende dall’attrito viscoso, che non è generalmente noto. Manipolazione magnetica inoltre è stato sviluppato e utilizzato in Drosophila, che coinvolgono l’utilizzo di ferrofluidi14 o liposomi ultramagnetic15. Essi possono fornire misure assolute16,17, ma sono anche invasivi nel senso che richiedono l’iniezione di sonde nella posizione desiderata. Questo può essere molto difficile a seconda del sistema, che non è sempre suscettibile di iniezioni di precise. Una terza tecnica, completamente non-invasiva, è forza inferenza18,19,20. Inferenza di forza si basa sull’ipotesi di equilibrio meccanico presso punti tripli (giunzioni tricellular, o vertici) e permette di dedurre le tensioni affatto cellulare contatti (e possibilmente, pressioni in tutte le cellule) di risolvere un problema inverso. Per le tensioni, ogni vertice fornisce due equazioni (X e Y). Questo produce un grande sistema di equazioni lineari che possono essere invertiti in alcune condizioni per valutare la tensione a tutti i contatti delle cellule. Mentre questo metodo è molto attraente, in quanto non richiede solo un’immagine segmentata e nessun esperimento supplementare o setup, sua precisione è ancora da determinare, e ancora fornisce solo valori relativi, a meno che non viene eseguita una misurazione di calibratura assoluta.
Per superare alcune di queste limitazioni, vi presentiamo in questo articolo un setup di pinzette ottiche accoppiato ad un microscopio foglio leggero applicare forze controllate alla scala delle cellule nell’epitelio embrionale di Drosophila melanogaster. Pinzette ottiche sono state utilizzate per numerose applicazioni biologiche compreso le misure sulle singole proteine e la manipolazione di cellule e organelli21. Qui, segnaliamo le forze applicate nel range di pochi dozzina pN, che è piccola ma sufficiente per indurre deformazioni locali di contatti cellula ed eseguire misure meccaniche in vivo. In genere, usiamo flessione perpendicolare di contatti cellula, monitorati attraverso l’analisi di chimografi, di relazionarsi forza alla deformazione. D’importanza, il nostro programma di installazione non richiede l’iniezione di perline nella posizione desiderata nel tessuto, come pinzette ottiche sono in grado di esercitare direttamente le forze su contatti cellula-cellula. L’accoppiamento delle pinzette ottiche ad un microscopio foglio leggero permette di eseguire la rappresentazione rapida (diversi fotogrammi al secondo), che è molto apprezzabile per un’analisi meccanica alle scale di breve tempo e con ridotta fototossicità, dato che l’illuminazione della il campione è limitato al piano del22di imaging.
Nel complessive, ottiche pinzette sono un modo non-invasivo per applicare forze controllate a contatti cellula in vivo l’embrione di Drosophila e per estrarre informazioni meccaniche come rigidità e tensione a cella contatti23, proprietà reologiche 24e gradiente o anisotropia di tensione23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pinzette ottiche permettono di effettuare misure meccaniche assolute direttamente nell’epitelio embrionale in via di sviluppo in maniera non invasiva. In questo senso, presenta vantaggi rispetto ad altri metodi, come l’ablazione laser, che sono invasive e forniscono misure relative, forze magnetiche, che richiedono iniezioni, o forzare l’inferenza, che si basa su ipotesi forte e anche forniscono relativa misurazioni.
Il protocollo comprende alcuni passaggi critici. In primo luogo, come la lent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da un FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (a P.-F.L.). Riconosciamo la Francia-bioimmagini infrastruttura supportata dal French National Research Agency (ANR-10-INBS-04-01, «Investimenti per il futuro»). Ringraziamo Detailleur Brice e Claude Moretti dall’infrastruttura PICSL-FBI per l’assistenza tecnica.
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
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