Проверка ячейки механики с шарик бесплатно Оптический пинцет в зародыша дрозофилы
Summary
Мы представляем установки Оптический пинцет, в сочетании с микроскопом света лист и ее осуществление зонда клеток механика без бисера в зародыша дрозофилы .
Abstract
Морфогенез требует координации между генетическими кучность и механических сил надежно формировать клеток и тканей. Таким образом чтобы понять морфогенетических процессов задача непосредственно измерить сотовой сил и механических свойств в vivo во время эмбриогенеза. Здесь мы представляем установки Оптический пинцет, в сочетании с микроскопом света лист, который позволяет непосредственно применять силы на ячейке контактов раннего зародыша дрозофилы , хотя изображений со скоростью несколько кадров в секунду. Этот метод имеет то преимущество, что она не требует инъекции бусины в эмбрион, обычно используются как промежуточные зондов, на которые оказывается оптической силы. Мы подробно, шаг за шагом, осуществление установки и предложить инструменты для извлечения механических информации из экспериментов. Путем мониторинга перемещения ячеек контактов в режиме реального времени, можно выполнить измерения напряженности и исследовать ячейку контакты реологии.
Introduction
Эмбриональное развитие является весьма воспроизводимый процесс, во время которой клетки и ткани деформировать формировать будущее животного. Показано, что таких деформаций, требуют активного поколения сил на уровне ячейки уровня1,2. Чтобы понять морфогенетических процессов, во время которых клетки и ткани изменить их форму, это поэтому ключ для оценки механических свойств клеток, участвующих и для измерения силы внутри ткани во время процесса3,4 . Эпителиального слоя, особенно у дрозофилы, были широко изучены вследствие их квази 2D геометрии и их легко манипулировать.
Ряд методов были разработаны таким образом, нас и другие оценки эпителиальных механики в vivo во время разработки. Мы дадим краткий обзор трех основных методов, используемых в эпителиальных тканях. Лазерная абляция, широко используемый метод, позволяет выявить местные механических напряжений в ячейку развязок5,6,,78 или в более крупных масштабах9,10,11 , выполняя местных сокращений, которые нарушают механическую целостность целевого объекта. Динамика открытия после разреза предоставляет информацию как на абляции предварительного напряжения, так и на реологические свойства ткани12,13. Недостатком лазерной абляции является, что это инвазивными, как это требует местной нарушение клетки коры. Следовательно один можно выполнять только ограниченное количество аблаций если один хочет, чтобы сохранить целостность ткани. Еще одним недостатком является аблаций только обеспечить относительной оценки напряженности в ячейку контакты, так как скорость открытия зависит вязкого трения, которые как правило не известна. Магнитные манипуляции также разработана и используется в дрозофилы, с участием либо использование магнитных жидкостей14 или15ultramagnetic липосом. Они могут обеспечить абсолютные измерения16,17, но также инвазивные в том смысле, что они требуют введения зонды в нужное место. Это может быть очень сложно, в зависимости от системы, которая не всегда поддаются точной инъекции. Третий метод, полностью неинвазивным,-силы вывод18,19,20. Вывод сил основывается на предположении о механических равновесия в три раза больше очков (tricellular развязок, или вершин) и позволяет вывести напряженности на всех ячеек контактов (и, возможно, давление во всех клетках), решения обратной задачи. Для напряженности каждая вершина предоставляет два уравнения (X и Y). Это дает большой системы линейных уравнений, которые могут быть инвертированы при некоторых условиях оценить напряжение на всех клеток контактов. Хотя этот метод является очень привлекательным, поскольку он требует только сегментирована изображения и без дополнительных эксперимент или установки, ее точность еще определить, и снова он предоставляет только относительные значения, если измерение абсолютной калибровки.
Чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений, мы представляем в этой статье установки Оптический пинцет в сочетании с микроскопом света лист применять контролируемых силами в масштабе ячеек в эпителии эмбриональных Drosophila melanogaster. Оптический пинцет были использованы для многочисленных биологических приложений, включая измерения на одном белков и манипуляции органеллы и клетки21. Здесь, мы приводим прикладной силы в диапазоне от нескольких десятков pN, который является небольшим еще достаточно, чтобы побудить местные деформации клетки контактов и выполнить механические измерения в естественных условиях. Как правило мы используем перпендикулярно прогиб клеток контактов, через анализ kymographs, контроль за относиться силы к деформации. Важно отметить, что наши установки не требует инъекции бусы на нужное место в ткани, как Оптический пинцет способны непосредственно оказывают силы на ячейке контактов. Муфта Оптический пинцет для Микроскоп свет листа позволяет выполнять быстрое изображений (несколько кадров в секунду), который является очень заметны для механического анализа на короткое время весы и с сокращением Фототоксичность, поскольку освещение Образец является ограниченной плоскости изображения22.
В целом, оптические пинцеты являются неинвазивный способ применить контролируемых силами в ячейку контакты in vivo в зародыша дрозофилы и для извлечения механических информации например, жесткость и напряженности в ячейку контакты23, реологические свойства 24и градиент или анизотропии напряженности23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оптический пинцет позволяют выполнять абсолютной механические измерения непосредственно в эпителии развивающихся зародышевых неинвазивным способом. В этом смысле он представляет преимущества перед другими методами, например лазерной абляции, которые являются инвазивными и предос?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана FRM Equipe Грант FRM DEQ20130326509, Agence Nationale де ла Recherche АНР-Blanc Грант, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (для P.-ф.л.). Мы признаем Франции-BioImaging инфраструктуры, поддержке французского национального исследования агентства (АНР-10-INBS-04-01, «Инвестиции в будущее»). Мы благодарим Брис Detailleur и Клод Moretti от PICSL-ФБР инфраструктуры для оказания технической помощи.
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
References
- Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
- Heisenberg, C. -. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), 186-196 (2016).
- Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
- Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
- Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
- Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
- Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Mitrossilis, D., Röper, J. -. C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
- Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
- Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
- Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
- Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
- Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
- Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
- Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
- Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
- Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).
