췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

Summary

췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

Abstract

격리 된 췌 장 독도 사용 하 여 실험은 당뇨병 연구를 위한 중요 하지만 독도 비싸고 한정 된 풍부의. 독도 포함 영향을 함수, 구조화 된 아키텍처에 혼합된 셀 인구 그리고 인간의 독도 널리 셀 형식 구성에서 변수. 교양된 독도 공부를 현재 자주 사용 되는 방법 분자 연구 수행 전체 독도, 총괄 한 이종 섬 세포 유형, 또는 현미경 또는 섬 건축을 방해 하는 분산 된 작은 섬 세포에 분자 연구에 포함 됩니다. Vivo에서 섬 연구, 파라핀 끼워 넣어진 췌 단면 네이티브 췌 장 환경에서 셀 관련 결과 평가 하기 위해 강력한 기술입니다. 여러 가지 이점을 제공할 것 이라고 파라핀 단면에 의해 후 문화 독도 공부: 같은 독도 (도 잠재적으로 정확한 같은 독도, 직렬 섹션을 사용 하 여), 셀 형식 관련 측정 및 유지 관리 기본에 여러 결과의 검출 섬-셀 및 셀 층 상호 작용 실험 노출 시 및 분석을 위해. 그러나, 기존 기술을 포함 고립 독도 후 비효율적인, 시간 소모, 소재의 손실에 수 그리 다 문화와 일반적으로 부적당 한 섬 숫자 결과 측정 하는 데 유용 해야 섹션을 생산. 임상 병 리 실험실 셀 블록 준비 시설 기초 연구 실험실에 대 한 허무 하 고 액세스할 수 있습니다. 우리는 강력한 수율 및 독도의 배포 섹션을 생성 하는 개선, 벤치 탑 메서드를 개발 했습니다. 고정된 독도 따뜻한 조직학 agarose 젤에 resuspended 하 고는 독도 평면에서 배포 되는 표준 유리 슬라이드에 플랫 디스크에 pipetted. 표준 탈수 후에 포함, 여러 (10 +) 4-5 µ m 섹션 같은 섬 블록에서 잘릴 수 있다. 이 메서드를 사용 하 여 마우스, 쥐, 인간 시리즈에 조직학 및 immunofluorescent 분석을 수행할 수 있습니다. 이것은 교양된 독도에서 셀 형식 관련, 건축이 그대로 결과 평가 하는 효과적인, 저렴 한, 시간-절약 접근.

Introduction

췌 장 독도 Langerhans, 인슐린, 순환의 유일한 소스는 당뇨병 mellitus를 공부 하는 수 사관에 대 한 중요 한 조직. 어떤 주어진된 유기 체에서 독도 가변 크기, 셀 유형 주파수, 및 건축^1,2,3있다. Vivo에서 구조와 췌 장 독도의 내 분 비 세포 구성 공부 하는 기존의 전략 췌 장 조직^4,5단면입니다. 콘텐츠의 전체 췌 장 세포의 작은 일부만 구성 하는 독도, 이후 고립 된 독도에 분자 연구 수행 됩니다. 비보 전 섬 문화 영양소에 대 한 응답을 테스트, 실험 유전자 변조 (transfection, 변환), 또는 실험적 치료 내 분 비 세포 생존, 확산, 및 기능을 조절 하는 메커니즘에 중요 한 통찰력을 제공 ^{5 , 6}.

섬 실험 비보 전 종종 전체 독도의 분자 연구 또는 단층^5,6에 성장 하는 분산 된 작은 섬 세포의 조직학 또는 분자 연구를 사용 하 여 분석 된다. 전체 독도의 분자 분석의 혼합과 세포 유형, 모든 개별 셀 형식을 추정 하는 경우 false 네거티브 또는 허위-긍정적인 결과 얻을 수 있는 심각한 경고를 소개 합니다. 이후 문화 현미경 검사 법에 대 한 coverslips에 셀 분산 셀 형식 관련 결과 측정, 있지만 섬 아키텍처, 개입에 대 한 응답을 변경할 수 있습니다 및 건축 관련 결과의 식별을 방해 방해. 또한, 일반적으로 단지 단일 결과 측정할 수 있다; 예를 들어 베타 세포 증식 및 동일한 조건 하에서 베타 세포 죽음을 측정, 두 개의 별도 실험 수행 해야 합니다. 이러한 방식을 간 섬 가변성, 분야에서 증가 관심의 영역에 눈도 있습니다. Cytometry 셀 형식 관련 분자 연구, 또는 단일 셀 RNA 연구에 의해 정렬 작은 섬 세포는 조직 풍부, 건축 근절, 그리고 일상적인 셀 문화 분석에 적합 하지 비싼, 시간이 걸리는 제한 하지만 우아한 ^{5 , 7}. 각 샘플에서 가져온 데이터 이며 단일 immunostaining⁸에 식별 가능한 결과 제한 confocal 영상 전체 마운트 immunostained 독도의 높은-품질 그대로 아키텍처 데이터를 제공 하지만 노동 집약, 이다.

-문화 전체 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하는 기능이이 관심사의 많은 주소 것 이다. 높은 비용, 낮은 풍부한 섬 조직 또는 인간 장기 기증자, 또는 독도 상태 게시물에 비보 또는 생체 외에서 실험 조작, 독특한 유전자 모델에서 귀중 한 있습니다. 같은 독도에서 여러 파라핀 섹션을 가져오는 동일한 실험에서 여러 셀 형식 관련, 그대로 건축 분석이 하게된다.

단면에 대 한 섬 펠 릿을 생성 하기 위해 기존 기술을 완벽 하지 않습니다. 조직학 최적화 agarose 어려운 과정⁹조각난 또는 작은 조직 샘플을 포함 하는 조직학 및 cytological 표본 처리에서 널리 이용 되는 수성 낮은 녹는점 젤입니다. 접근을 포함 한 섬 agarose microcentrifuge 튜브에서에 독도 일시 중단, 원심 작은 자료, agar 플러그를 검색 다음 처리 하 고^10,11단면에 대 한 포함입니다. 튜브의 아래쪽에서 응고 샘플을 추출 시간이 많이 걸리며 어려운, 샘플의 가끔 조각화 및 신체 상해의 위험입니다. 독도이 방법에서 얻은 단원의 부적절 한 섬 분포 선도 플러그의 끝에 집중 된다. 플러그의 둥근 바닥 복잡 포함 되도록 섬-가난한 지역 단면 제시 될 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 낮은 수율 및 결과 섹션에서 이멀전의 섬 유통 리드.

이 새로운 방법은 섬 섹션의 준비에 대 한 단순 하 고 향상 된 접근 이다. 독도 작은 볼륨에 집중 하 고 단일 평면에 독도와 작은 디스크를 현미경 슬라이드의 매끄러운 표면에 배치. Histogel-섬 디스크 파라핀 단축된 탈수 및 자일 렌 침투 프로토콜에 대 한 이후 처리 됩니다. Microfuge 관의 하단에 독도 집중, 이전 접근은 또한 비교로 수행 됩니다. 이 새로운 기술은 섹션, 각 섹션에서 독도의 유통 당 독도의 수율 향상과 카세트 섬 블록 전송 하는 데 시간이 적게 걸립니다. 이 기술은 유용 섬 생물학 또는 생산성을 극대화 하고자 하는 조직의 작은 조각을 공부 하는 다른 과학자의 기본 조직 아키텍처에서 단일 샘플에 여러 결과 측정 하 여 낮은 풍부 조직 사용.

Protocol

동물 관련 된 모든 절차는 UMass 의료 학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다. 인간의 섬 연구는 인간을 대상의 사용을 포함 하지 않는 때문에 IRB 검토 또는 면제에 대 한 자격 하지 UMass 기관 검토 위원회에 의해 결정 했다.

1. 섬 격리와 문화

1. 독도 분리 하 고 외 분 비 및 ductal 조직 선택의 방법을 사용 하 여 오염에서 분리.
   참고:이 방법은 독도 콜라 duc…

Representative Results

젤 디스크를 준비 하는 단계의 그림된 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 이 젤 디스크 메서드 결과 결과의 의미 있는 정량화를 허용 하는 단일 평면에 배포 하는 독도의 충분 한 수를 포함 하는 파라핀 섹션에서. 그림 2 는 독도 섹션 당 캡처 수를 설명 하기 위해 결과 섹션의 낮은 확대 이미지. 일반적으로, > 250 IEQ 절차, 사용 되었다…

Discussion

이 수정된 젤 디스크-기반 포함 메서드는 단순, 저렴 한, 및 섹션 당 독도의 높은 수율을 생성 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. 평면 유리 표면에 젤 디스크 구성 동등한 배급에 퍼지는 독도 용이 하 게 잘 정의 된 영역. 평면 디스크에 독도 확산 섹션의 비행기에 많은 독도 배치 하 고, 수확량을 최적화 하 고 적은 독도 사용할 수 있도록의 이점을 제공 합니다. 디스크 두께 수 사관의 요구에 맞게…

Materials

1.5 mL Eppendorf tube	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic Starter Kit	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Low Binding Tip (1000 μL)	Genesee Scientific	24-430
Low Binding Tip (200 μL)	Genesee Scientific	24-412
Low Binding Tip (20 μL)	Genesee Scientific	24-404
Low Binding Tip (10 μL)	Genesee Scientific	24-401
10% Formalin solution	Sigma	HT501128
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Agarose blue beads- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco's PBS	Life technologies	14190-144
Tissue processing cassette	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 tissue processor	Thermo-Shandon LLC
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, INC	2701
Xylene	Fisher Chemical	X5SK-4
Paraffin	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Insulin antibody	DAKO	A0564
Glucagon antibody	Sigma	G2654
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 secondary antibodies	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 secondary antibodies	Life technologies	A11001