جزيرة البنكرياس التضمين لمقاطع البارافين
Summary
السابقين فيفو الدراسات جزيرة البنكرياس تعتبر هامة لأبحاث مرض السكري. التقنيات القائمة لدراسة الجزيرات المزروعة في بهم العمارة 3 الأبعاد الأصلية مضيعة للوقت وغير كفؤة، والمستخدمة بشكل متكرر. ويصف هذا العمل طريقة جديدة وبسيطة وفعالة لتوليد مقاطع البارافين عالية الجودة من الجزيرات مثقف كلياً.
Abstract
تجارب باستخدام جزيرات البنكرياس معزولة هاما لأبحاث مرض السكري، ولكن الجزر الصغيرة مكلفة ومحدودة الوفرة. الجزر الصغيرة تحتوي على عدد خلايا مختلطة في هيكل منظم الآثار الدالة والجزيرات البشرية على نطاق واسع متغير في تكوين نوع الخلية. وتشمل الأساليب الحالية المستخدمة بشكل متكرر لدراسة الجزيرات مثقف الجزيئية دراسات أجريت على الجزر كله أو فاعلين جزيرة تباين أنواع الخلايا معا، أو الفحص المجهري أو الدراسات الجزيئية في خلايا الجزيرة الصغيرة المتناثرة، تعطيل العمارة جزيرة ليلى. في فيفو الدراسات جزيرة ليلى، جزءا لا يتجزأ من البارافين البنكرياس تمزيقها تقنية قوية لتقييم النتائج الخاصة بالخلايا في البنكرياس البيئة الأصلية. دراسة ثقافة ما بعد الجزر بتقطيع البارافين سيوفر العديد من المزايا: الكشف عن نتائج متعددة على نفس الجزيرات (يحتمل حتى بالضبط نفس الجزر الصغيرة، باستخدام مقاطع المسلسل) وقياسات خلية-نوع معين، والحفاظ على مواطن جزيرة خلية خلية والخلية-التحتية التفاعلات أثناء التعرض التجريبية والتحليل. ومع ذلك، عزل التقنيات الموجودة لتضمين الجزيرات الثقافة بعد هي غير فعالة، وتستغرق وقتاً طويلاً، وعرضه لفقدان المواد وتنتج عموما المقاطع مع أرقام جزيرة ليلى غير كافية أن تكون مفيدة للتحديد الكمي لنتائج. مرافق إعداد كتلة الخلايا مختبر علم الأمراض السريرية غير قابل للوصول وغير عملي لمختبرات البحوث الأساسية. قمنا بتطوير أسلوب أعلى مقاعد البدلاء المحسنة والمبسطة التي تنشئ المقاطع ذات غلة قوية والتوزيع للجزر الصغيرة. الجزر الصغيرة الثابتة حراكه في الحارة النسيجي [اغروس] هلام وبيبيتيد إلى قرص ثابت على شريحة زجاج قياسية، مثل أن الجزر الصغيرة توزع في طائرة. بعد الجفاف القياسي والتضمين، يمكن قص (10 +) 4-5 ميكرومتر مقاطع متعددة من نفس الكتلة جزيرة ليلى. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن إجراء تحاليل نسيجية وإيمونوفلوريسسينت على الماوس وفار والجزيرات البشرية. هذا نهج فعالة وغير مكلفة وتوفير الوقت لتقييم نتائج الخلية-نوع محدد، وبنية سليمة من الجزيرات المستزرعة.
Introduction
البنكرياس جزر لانجرهانز، المصدر الوحيد لتعميم الأنسولين، أنسجة الحيوية للمحققين يدرسون مرض البول السكري. من أي كائن حي معين، قد الجزيرات حجم متغير وتردد نوع الخلية والهندسة المعمارية1،،من23. الاستراتيجية التقليدية للدراسة في فيفو هيكل وتكوين خلية الغدد الصماء من جزيرات البنكرياس بتقطيع بنكرياس الأنسجة4،5. أن الجزر تشكل سوى جزء صغير من إجمالي المحتوى الخلوية البنكرياس، تجري الدراسات الجزيئية على الجزر الصغيرة المعزولة. السابقين فيفو جزيرة الثقافة التجارب اختبار استجابة للمواد الغذائية، والتحوير الجيني (تعداء، تنبيغ)، أو علاجات تجريبية توفير نظرة ثاقبة آليات تحوير بقاء الخلية الغدد الصماء، والانتشار، ووظيفة هامة 5 , 6.
السابقين فيفو تجارب جزيرة صغيرة غالباً ما يتم تحليل استخدام الدراسات الجزيئية للجزر كله أو دراسات نسيجية أو الجزيئية للخلايا جزيرة متناثرة نمت في أحادي الطبقة5،6. التحليل الجزيئي للجزر كله يدخل التحذير الشديد من تمازج أنواع الخلايا، مما قد يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة أو إيجابية كاذبة عند استقراء لأي نوع من الخلايا الفردية. تشتت الخلية على كوفيرسليبس للثقافة بعد انتهاء الفحص المجهري يتيح قياس نتائج الخلية-نوع معين، ولكن يعطل العمارة جزيرة ليلى، والتي قد تغير استجابة للتدخل، ويحول دون تحديد النتائج المتعلقة بالهندسة المعمارية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن قياس عموما من التوصل إلى نتيجة واحدة فقط؛ على سبيل المثال، تحتاج تجربتين منفصلتين لقياس انتشار الخلايا بيتا وموت الخلايا بيتا نفس الظروف، التي يتعين القيام بها. وأيضا هذه النهج الأعمى لتقلب بين جزيرة ليلى، مجال يحظى باهتمام متزايد في المجال. فرز الخلايا جزيرة ليلى بالتدفق الخلوي للدراسات الجزيئية الخليوي-نوع معين، أو دراسات الحمض النووي الريبي خلية واحدة أنيقة لكنها محدودة، مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، بوفرة الأنسجة، القضاء على الهندسة المعمارية، وليست ملائمة تماما لتحليلات ثقافة الخلية الروتينية 5 , 7-تصوير [كنفوكل] من الجزيرات الجامع-جبل إيمونوستينيد ويقدم بيانات سليمة هندسة عالية الجودة، ولكن كثيفة العمالة، والبيانات التي تم الحصول عليها من كل عينة محدودة إلى نتائج يمكن تحديدها في إيمونوستينينج واحدة8.
القدرة على توليد مقاطع البارافين عالية الجودة من الجزيرات كله الثقافة بعد انتهاء سيتناول العديد من هذه الشواغل. جزيرة عالية التكلفة، ومنخفضة-وفرة الأنسجة من النماذج الوراثية الفريدة أو من الجهات المانحة الجهاز البشري، أو الجزر حالة وظيفة فيفو في أو في المختبر التجريبي التلاعب، الثمينة. الحصول على عدة مقاطع البارافين من الجزيرات نفس سيسمح تحليل الخلية-نوع محدد، وبنية سليمة متعددة من نفس التجربة.
التقنيات القائمة على توليد الكريات جزيرة ليلى لتمزيقها ناقصة. هو محسن لعلم الأنسجة [اغروس] هلام مائي نقطة انصهار منخفضة يستخدم على نطاق واسع في تجهيز عينات نسيجية والخلوية بما في ذلك عينات الأنسجة الصغيرة أو المجزأة التي يصعب عملية9. جزيرة واحدة تضمين نهج هو تعليق الجزر الصغيرة في [اغروس] في أنبوب ميكروسينتريفوجي، والطرد المركزي لبيليه بالمواد، واسترداد المكونات أجار، ثم عملية وتضمين لتقطيع10،11. استخراج عينة طدت من الجزء السفلي من الأنبوب وقتاً طويلاً وصعبا، مما أدى إلى تجزئة العينة العرضية وخطر الإصابة الشخصية. الجزر الصغيرة تتركز في غيض المكونات، مما يؤدي إلى توزيع جزيرة ليلى غير كافية في الأجزاء التي تم الحصول عليها من هذا الأسلوب. جولة أسفل المكونات تعقيد التضمين مثل أنه قد قدم في منطقة ايميا-الفقراء لتمزيقها. وعموما، هذا الأسلوب يؤدي إلى منخفضة الغلة وتوزيع جزيرة تحبب خفيف في الأقسام الناتجة.
هذا الأسلوب الجديد نهج مبسطة ومحسنة للتحضير لأقسام جزيرة ليلى. الجزر الصغيرة تتركز في حجم صغير وثم وضعت على سطح أملس لشريحة المجهر شكل قرص صغير، مع الجزر في طائرة واحدة. تتم معالجة القرص هيستوجيل-جزيرة لاحقاً البارافين التضمين في تقصير الجفاف وبروتوكول تسلل زيلين نفط. ويتم أيضا النهج السابق، الذي يركز الجزر الصغيرة في الجزء السفلي من أنبوب [ميكروفوج]، على سبيل مقارنة. هذا الأسلوب الجديد يحسن عائد الجزيرات كل قسم، توزيع الجزر الصغيرة في كل قسم، ووقتاً أقل لنقل كتل جزيرة ليلى إلى أشرطة الكاسيت. هذا الأسلوب مفيد لعلماء الأحياء جزيرة ليلى أو غيره من العلماء الذين يدرسون قطع صغيرة من الأنسجة الراغبين في تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية استخدام الأنسجة وفرة منخفضة بقياس نتائج متعددة في عينة واحدة في هندسة الأنسجة الأصلية به.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا الأسلوب التضمين معدلة هلام-المستندة إلى قرص بسيطة وغير مكلفة، وطريقة فعالة لتوليد عائد عالية من الجزيرات كل قسم. بناء القرص جل على سطح زجاج مسطح يسهل انتشار الجزر إلى توزيع حتى على مساحة محددة تحديداً جيدا. نشر الجزيرات في قرص ثابت يوفر ميزة وضع العديد من الجزر الصغيرة في طائرة ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعترف مع الامتنان المجموعة بيولوجيا الخلية بيتا في مركز التميز السكري UMass لنصائح مفيدة ومناقشات. وقدمت جزيرات البنكرياس البشرية بالممول نيدك المتكاملة جزيرة ليلى توزيع البرنامج (إييدب) في مدينة الأمل. تم تمويل هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة/نيدك: R01-DK114686 (LCA)، R01-DK105837 (CY)، 2UC4DK098085 (إييدب)، ومن “الرابطة الأمريكية لمرض السكري” منحة #1-15-بكالوريوس-003 (LCA) بالتعاون مع النظام القطيفة.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
