Alvleesklier Islet insluiten voor paraffine secties

Summary

Ex vivo alvleesklier islet studies zijn belangrijk voor onderzoek naar diabetes. Bestaande technieken om te studeren van gekweekte eilandjes in hun oorspronkelijke 3-dimensionale architectuur zijn zelden gebruikte, tijdrovend en inefficiënt. Dit werk beschrijft een nieuwe, eenvoudige en efficiënte methode voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige paraffine secties van hele gekweekte eilandjes.

Abstract

Experimenten met behulp van geïsoleerde alvleesklier eilandjes zijn belangrijk voor onderzoek naar diabetes, maar eilandjes zijn duur en van beperkte overvloed. Eilandjes bevatten een gemengde celpopulatie in een gestructureerde architectuur invloed op functie en menselijke eilandjes zijn wijd variabele in cel type samenstelling. Huidige veelgebruikte methoden om te studeren van gekweekte eilandjes omvatten moleculaire onderzoeken uitgevoerd op hele eilandjes, eerste ongelijksoortige islet celtypes samen, of microscopie moleculaire studies over verspreide eilandjecellen, verstoren het eilandje platform. Voor in vivo islet studies is paraffine-ingebedde alvleesklier segmenteren een krachtige techniek om te beoordelen van cel-specifieke resultaten in de oorsprong van de alvleesklier. Studeren na cultuur eilandjes door paraffine afdelen zou bieden verschillende voordelen: detectie van meerdere resultaten op de dezelfde eilandjes (mogelijk zelfs de exacte dezelfde eilandjes, met behulp van seriële secties), cel-type-specifieke metingen en handhaving native eilandje cel-cel en cel-substraat interacties tijdens de experimentele blootstelling zowel voor analyse. Maar geïsoleerde bestaande technieken voor het insluiten van eilandjes na cultuur zijn inefficiënt, tijdrovend en gevoelig voor verlies van materiaal, en in het algemeen produceren secties met onvoldoende islet nummers nuttig voor het kwantificeren van de resultaten. Klinische pathologie laboratoriumfaciliteiten cel blok voorbereiding zijn ontoegankelijk en onpraktisch voor fundamenteel onderzoekslaboratoria. We hebben een betere, vereenvoudigde methode van bench-top dat secties met robuuste opbrengst en verdeling van de eilandjes genereert ontwikkeld. Vaste eilandjes zijn geresuspendeerde in warme histologische agarose gel en afgepipetteerde in een platte schijf op een standaard glasplaatje, zodanig dat de eilandjes worden gedistribueerd in een vliegtuig. Na standaard uitdroging en insluiten, kunnen meerdere (10 +) 4-5 µm secties worden gesneden uit hetzelfde islet blok. Met deze methode kunnen histologische en immunefluorescentie analyses worden uitgevoerd op de muis, rat en menselijke eilandjes. Dit is een effectieve, goedkope, tijdbesparende aanpak om te beoordelen van de resultaten van de cel-type-specifieke, intact-architectuur van gekweekte eilandjes.

Introduction

Pancreas: eilandjes van Langerhans, de enige bron van het Circulerend insuline, zijn een kritische weefsel voor onderzoekers bestuderen van diabetes mellitus. Van een bepaald organisme hebben eilandjes variabele grootte, cel type frequentie en het platform^1,2,3. De conventionele strategie om te studeren in vivo structuur en samenstelling van de endocriene cellen van de alvleesklier eilandjes is door de alvleesklier weefsel^4,5te segmenteren. Aangezien de eilandjes vormen slechts een klein deel van de alvleesklier cellulaire totaalgehalte, worden moleculaire studies uitgevoerd op geïsoleerde eilandjes. Ex vivo islet cultuur experimenten, testen van de reactie op de voedingsstoffen, bieden gene modulatie (transfectie, transductie) of experimentele behandelingen belangrijk inzicht verschaffen in de mechanismen moduleren van overleving van de endocriene cel proliferatie en functie ^{5 , 6}.

Ex vivo islet experimenten worden vaak geanalyseerd met behulp van moleculaire studies van hele eilandjes of histologische of moleculaire studies van verspreide eilandjecellen gegroeid in enkelgelaagde^5,6. Moleculaire analyse van hele eilandjes introduceert de ernstige waarschuwing van vermenging celtypes, die vals-negatieve of vals-positieve resultaten wanneer geëxtrapoleerd naar elk afzonderlijke celtype kan produceren. Cel dispersie op coverslips voor microscopie na cultuur staat van cel-type-specifieke resultaten meting, maar verstoort islet architectuur, die reactie op interventie kan wijzigen en zich verzet tegen de identificatie van het platform-gerelateerde resultaten. Daarnaast, worden in het algemeen slechts een enkel resultaat uitgedrukt; bijvoorbeeld, voor het meten van beta celproliferatie en beta celdood onder dezelfde voorwaarden, twee aparte experimenten moeten worden uitgevoerd. Deze benaderingen zijn ook blind voor inter islet variabiliteit, een ruimte van toenemende belangstelling voor het veld. Sorteer eilandjecellen door stroom cytometry voor cel-type-specifieke moleculaire studies of eencellige RNA studies zijn elegant maar duur, tijdrovend, beperkt door weefsel overvloed, uitroeiing van het platform, en niet geschikt zijn voor routinematige cel cultuur analyses ^{5 , 7}. confocal beeldvorming van geheel-mount immunostained eilandjes levert kwalitatief hoogwaardige intact-architectuur gegevens, maar is arbeidsintensief, en gegevens die zijn verkregen van elk monster is beperkt tot resultaten identificeerbare in een enkele immunokleuring⁸.

De mogelijkheid voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige paraffine secties van de hele eilandjes na cultuur zou kunnen veel van deze zorgen worden aangepakt. Hoge kosten, lage-overvloed islet weefsel van unieke genetische modellen of uit menselijke orgaandonoren of eilandjes status bericht in vivo of in vitro experimentele manipulatie, zijn kostbaar. Verkrijgen van meerdere paraffine secties van de dezelfde eilandjes zou meerdere cel-type-specifieke, intact-architectuur analyses van hetzelfde experiment.

Bestaande technieken voor het genereren van islet pellets voor afdelen zijn onvolmaakt. Histologie-geoptimaliseerde agarose is een waterige laag smeltpunt gel die veel gebruikt wordt bij de verwerking van histologische en cytologische specimens, met inbegrip van kleine en gefragmenteerde weefselsteekproeven die moeilijk te proces⁹. Een eilandje aanpak te embedding is naar de eilandjes in de agarose in de buis van een microcentrifuge op te schorten, centrifugeer pellet van het materiaal, ophalen van de agar stekker, dan verwerken en embed voor afdelen^10,11. Het uitpakken van het gestolde monster uit de onderkant van de buis is tijdrovend en moeilijk, wat leidt tot occasionele fragmentatie van het monster en risico van lichamelijk letsel. De eilandjes zijn geconcentreerd in het uiteinde van de stekker, leiden tot onvoldoende islet verdeling in secties die deze methode verkregen. De ronde onderkant van de stekker compliceert insluiten zodat een eilandje-arme regio kan worden aangeboden voor het segmenteren. Globaal, is deze methode leidt tot lage rendement en geklonterd islet distributie in de resulterende secties.

Deze nieuwe methode is een vereenvoudigde en verbeterde aanpak voor de voorbereiding van de secties van het eilandje. Eilandjes zijn geconcentreerd in een klein volume en vervolgens geplaatst op het gladde oppervlak van een microscoopglaasje vormen een kleine schijf, met de eilandjes in een enkel vliegtuig. De Histogel-islet schijf wordt vervolgens verwerkt voor paraffine insluiten in een verkorte uitdroging en xyleen infiltratie protocol. De vorige benadering, die zich de eilandjes in de bodem van een microfuge buis concentreert, wordt ook uitgevoerd als een vergelijking. Deze nieuwe techniek verbetert het rendement van eilandjes per sectie, de verdeling van de eilandjes in elke sectie en kost minder tijd om de islet blokken naar cassettes. Deze techniek is handig voor islet biologen of andere wetenschappers bestuderen van kleine stukjes weefsel productieve willen maximaliseren van het gebruik van een lage-overvloed weefsel door het meten van meerdere resultaten op een monster in de architectuur van het oorspronkelijke weefsel.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren zijn door de UMass Medical School institutionele Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd. Menselijke islet studies waren door de UMass institutionele Review Board vastbesloten niet in aanmerking voor IRB review of vrijstelling omdat zij niet hebben betrekking op het gebruik van menselijke proefpersonen. 1. islet isolatie en cultuur Isoleren van eilandjes en scheiden van contaminerende exocrine en ductaal weefsel met behulp van de methode van uw keuze…

Representative Results

Een geïllustreerde schematische voorstelling van de stappen ter voorbereiding van de gel-schijf wordt weergegeven in Figuur 1. Deze gel disc methode resulteert in paraffine secties met een voldoende aantal eilandjes verspreid in een enkel vliegtuig dat zinvolle kwantificering van resultaten. Figuur 2 toont beelden van de lage-vergroting van de resulterende secties om te illustreren het aantal eilandjes gevangen per sectie. In he…

Discussion

Deze gewijzigde gel schijf-gebaseerde insluiten methode biedt een eenvoudige, goedkope en efficiënte manier voor het genereren van een hoog rendement van eilandjes per sectie. Bouw van de gel-schijf op een plat glazen oppervlak vergemakkelijkt verspreiden eilandjes in een gelijkmatige verdeling over een welomschreven gebied. Verspreiding van de eilandjes in een platte schijf biedt het voordeel van het plaatsen van de vele eilandjes in het langsvlak van deel, optimaliseren van rendement en waardoor minder eilandjes worde…

Materials

1.5 mL Eppendorf tube	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic Starter Kit	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Low Binding Tip (1000 μL)	Genesee Scientific	24-430
Low Binding Tip (200 μL)	Genesee Scientific	24-412
Low Binding Tip (20 μL)	Genesee Scientific	24-404
Low Binding Tip (10 μL)	Genesee Scientific	24-401
10% Formalin solution	Sigma	HT501128
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Agarose blue beads- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco's PBS	Life technologies	14190-144
Tissue processing cassette	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 tissue processor	Thermo-Shandon LLC
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, INC	2701
Xylene	Fisher Chemical	X5SK-4
Paraffin	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Insulin antibody	DAKO	A0564
Glucagon antibody	Sigma	G2654
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 secondary antibodies	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 secondary antibodies	Life technologies	A11001