Summary
Ex vivo i bugspytkirtlen islet undersøgelser er vigtige for diabetes research. Eksisterende teknikker til at studere kulturperler Holme i deres native 3-dimensionelle arkitektur er tidskrævende, ineffektiv og sjældent brugt. Dette arbejde beskriver en ny, enkel og effektiv metode for at skabe høj kvalitet paraffinsnit af hele kulturperler Holme.
Abstract
Eksperimenter ved hjælp af isolerede pancreas Holme er vigtige for diabetes forskning, men Holme er dyre og af begrænset overflod. Holme indeholder en blandet celle befolkning i en struktureret arkitektur, der påvirker funktionen, og menneskelige Holme er meget variabel i celle type sammensætning. Nuværende hyppigt anvendte metoder til at studere kulturperler Holme omfatter molekylære undersøgelser udført på hele Holme, overbegreb uensartede islet celletyper sammen, eller mikroskopi eller molekylære undersøgelser på spredte islet celler, forstyrre islet arkitektur. For i vivo islet undersøgelser er paraffin-embedded bugspytkirtlen skæring en kraftfuld teknik til at vurdere celle-specifikke resultater i de indfødte i bugspytkirtlen miljø. At studere efter kultur Holme af paraffin skæring vil tilbyde flere fordele: påvisning af flere resultater på samme Holme (potentielt selv de eksakt samme Holme, ved hjælp af seriel afsnit), celle-type-specifikke målinger og opretholde indfødte Islet celle-celle og celle-undergrundens interaktioner både under eksperimentelle eksponering og analyse. Dog isoleret eksisterende teknikker til at indbygge Holme efter kultur er ineffektive, tidskrævende, tilbøjelige til tab af materiale, og generelt producere sektioner med utilstrækkelig islet tal at være nyttig til at kvantificere resultaterne. Klinisk Patologi laboratorium cell block forberedelse faciliteter er utilgængelige og upraktisk for grundlæggende forskningslaboratorier. Vi har udviklet en forbedret og forenklet bænk-top metode, der genererer sektioner med robust udbytte og distribution af Holme. Fast Holme er genopslemmes i varm histologiske agarosegel og pipetted i en flad skive på en standard glas dias, sådan at holmene er fordelt i et fly. Efter standard dehydrering og indlejring, kan flere (10 +) 4-5 µm sektioner skæres fra samme islet blok. Brug denne metode, kan histologiske og immunfluorescent analyser udføres på mus, rotter og menneskelige Holme. Dette er en effektiv, billig, tidsbesparende tilgang til at vurdere celle-type-specifikke, intakt-arkitektur resultater fra kulturperler Holme.
Introduction
Pancreas Holme af Langerhanske, den eneste kilde af cirkulerende insulin, er et kritisk væv for efterforskerne at studere diabetes mellitus. Fra enhver given organisme har Holme variabel størrelse, celle type frekvens og arkitektur1,2,3. Den konventionelle strategi at studere i vivo struktur og endokrine celle sammensætning af pancreas Holme er ved at inddele bugspytkirtlen væv4,5. Da Holme udgør kun en lille brøkdel af pancreas cellulære totalindholdet, er molekylære undersøgelser udført på isolerede småøer. Ex vivo islet kultur eksperimenter test svar på næringsstoffer, give gen graduering (Transfektion, transduktion) eller eksperimentelle behandlinger vigtig indsigt i mekanismerne modulerende endokrine celle overlevelse, spredning og funktion 5 , 6.
Ex vivo islet eksperimenter er ofte analyseret ved hjælp af molekylære studier af hele Holme eller histologiske eller molekylære studier af spredte islet celler dyrkes i éncellelag5,6. Molekylær analyse af hele Holme introducerer den alvorlige hage af iblanding celletyper, som kan producere falsk negative eller falsk-positive resultater, når de ekstrapoleres til enhver individuel celletype. Celle spredningen på coverslips til post kultur mikroskopi tillader celle-type-specifikke resultat måling, men forstyrrer islet arkitektur, som kan ændre svar til intervention og udelukker identifikation af arkitektur-relaterede resultater. Derudover kan generelt kun en enkelt resultat måles; for eksempel, for at måle beta celleproliferation og beta celledød på samme betingelser, skal to separate forsøg udføres. Disse tilgange er også blind for Inter islet variabilitet, et område af voksende interesse for feltet. Sortering ø-celler ved flowcytometri for celle-type-specifikke molekylære undersøgelser eller encellede RNA undersøgelser er elegant men dyrt, tidskrævende, begrænset af væv overflod, udryddelse af arkitektur, og ikke velegnet til rutinemæssig celle kultur analyser 5 , 7. Konfokal billeddannelse af hele-mount immunostained Holme giver data af høj kvalitet intakt-arkitektur, men er arbejdskraftintensive, og data indhentet fra hver prøve er begrænset til resultater kan identificeres i en enkelt immunfarvning8.
Mulighed for at skabe høj kvalitet paraffinsnit af post kultur hele Holme vil løse mange af disse bekymringer. Høje omkostninger, lav-overflod islet væv fra unikke genetiske modeller eller menneskelige organdonorer, eller Holme status post in vivo eller in vitro- eksperimentelle manipulation, er værdifulde. At opnå flere paraffinsnit fra de samme øer ville tillade flere celle-type-specifikke, intakt-arkitektur analyser fra det samme eksperiment.
Eksisterende teknikker til at generere islet pellets til skæring er ufuldkommen. Histologi-optimeret Agarosen er en vandig lavt smeltepunkt gel, der er almindeligt anvendt i behandlingen af histologiske og cytologiske prøver herunder små eller fragmenterede vævsprøver, som er vanskelige at processen9. Én islet indlejring tilgang er at suspendere holmene i Agarosen i et microcentrifuge rør, centrifugeres pellet materialet, hente plug agar og derefter behandle og integrere for skæring10,11. Uddrager den størknede prøve fra bunden af røret er tidskrævende og vanskeligt, fører til lejlighedsvis fragmentering af prøven og risiko for personskade. Holmene er koncentreret i spidsen af stik, fører til utilstrækkelig islet distribution i sektioner fra denne metode. Runde bunden af stikket komplicerer indlejring sådan, at en Holmen-fattige region kan blive præsenteret for skæring. Samlet set fører denne metode til lavt udbytte og klumpet islet distribution i de efterfølgende afsnit.
Denne nye metode er en forenklet og forbedret metode til forberedelse af holmen sektioner. Holme er koncentreret i en lille mængde og derefter placeret på den glatte overflade af et objektglas til at danne en lille skive med Holme i et enkelt fly. Histogel-Holmen disken er efterfølgende behandlet for paraffin indlejring i en forkortet dehydrering og xylen infiltration protokol. Den tidligere tilgang, som koncentrerer sig Holme i bunden af et mikrofuge rør, er også udført som en sammenligning. Denne nye teknik forbedrer udbyttet af Holme pr. sektion, fordelingen af Holme i hvert afsnit, og tager mindre tid til at overføre islet blokke til kassetter. Denne teknik er nyttig til Holmen biologer og andre forskere studerer små stykker af væv, der ønsker at maksimere produktiv brug af en lav-overflod væv ved at måle flere resultater på en enkelt prøve i sin oprindelige væv arkitektur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne modificerede gel-disk-baserede indlejring metode giver en enkel, billig, og effektiv måde at generere et højt udbytte af Holme pr. sektion. Konstruere gel disken på en flad glasoverflade letter sprede Holme i en jævn fordeling over et veldefineret område. Sprede Holme i en flad skive tilbyder fordelen, at placere mange Holme i flyet af afsnit, optimere udbyttet og giver færre Holme skal anvendes. Disc tykkelse kan justeres til at opfylde efterforskernes behov. Da flere sektioner kan opnås, kan seriel dele af…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi parlamentsarbejdet gruppen Beta Cell Biology på UMass Diabetes Center of Excellence for nyttige råd og diskussioner. Menneskelige pancreas Holme blev leveret af den NIDDK-finansierede integrerede Islet Distribution Program (IIDP) på City of Hope. Dette arbejde blev finansieret af NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) og af American Diabetes Association yde #1-15-BS-003 (LCA) i samarbejde med rækkefølgen af amarant.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
