आयल सेक्शन के लिए अग्नाशय टाप एंबेडिंग
Summary
Ex vivo अग्नाशय टाप अध्ययन मधुमेह अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं । मौजूदा तकनीक अपने मूल 3 आयामी वास्तुकला में संस्कृतिपूर्ण टाप का अध्ययन करने के लिए समय लेने वाले हैं, अक्षम है, और अक्सर इस्तेमाल किया । यह काम पूरे कल्चरल टाप के उच्च गुणवत्ता वाले आयल वर्गों को पैदा करने के लिए एक नई, सरल और कुशल विधि का वर्णन करता है ।
Abstract
अलग अग्नाशय के टाप का उपयोग प्रयोगों मधुमेह अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन टाप महंगा और सीमित बहुतायत के होते हैं । टाप एक संरचित वास्तुकला में एक मिश्रित कोशिका जनसंख्या होते है कि प्रभाव समारोह, और मानव टाप सेल प्रकार संरचना में व्यापक रूप से चर रहे हैं । वर्तमान में अक्सर इस्तेमाल किया विधियों का अध्ययन करने के लिए प्रसंस्कृत टाप में पूरे टाप पर प्रदर्शन आणविक अध्ययन शामिल हैं, लादू असमान टाप सेल प्रकार एक साथ, या माइक्रोस्कोपी या आणविक अध्ययन फैलाया टाप कोशिकाओं पर, टाप वास्तुकला में खलल डालना. वीवो टाप स्टडीज में के लिए, आयल-एंबेडेड अग्ंयाशय खंड एक शक्तिशाली तकनीक देशी अग्नाशय के वातावरण में कोशिका विशिष्ट परिणामों का आकलन है । के बाद अध्ययन के तेल अनुभागीकरण द्वारा संस्कृति टाप कई लाभ की पेशकश करेगा: एक ही टाप पर एकाधिक परिणामों का पता लगाने (संभवतः भी सटीक-एक ही टाप, धारावाहिक वर्गों का उपयोग), सेल-प्रकार-विशिष्ट माप, और बनाए रखने देशी दोनों प्रयोगात्मक जोखिम के दौरान और विश्लेषण के लिए टाप सेल-सेल और सेल-बुनियाद बातचीत । हालांकि, अलग टाप पोस्ट संस्कृति embedding के लिए मौजूदा तकनीक अक्षम हैं, समय लगता है, सामग्री के नुकसान की संभावना है, और आम तौर पर अपर्याप्त टाप संख्या के साथ वर्गों का उत्पादन परिणामों को बढ़ाता है के लिए उपयोगी हो । नैदानिक पैथोलॉजी प्रयोगशाला सेल ब्लॉक तैयारी सुविधाएं दुर्गम और बुनियादी अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए अव्यावहारिक हैं । हम एक बेहतर विकसित की है, बेंच-टॉप विधि सरलीकृत कि मजबूत उपज और टाप के वितरण के साथ वर्गों उत्पंन करता है । फिक्स्ड टाप गर्म ऊतकवैज्ञानिक agarose जेल और pipetted में एक मानक गिलास स्लाइड पर एक फ्लैट डिस्क में reसस्पैंड कर रहे हैं, इस तरह है कि एक विमान में टाप वितरित कर रहे हैं । मानक निर्जलीकरण और embedding के बाद, एकाधिक (10 +) 4-5 µm वर्गों को एक ही टाप ब्लॉक से काटा जा सकता है । इस विधि का प्रयोग, ऊतकवैज्ञानिक और immunofluorescent विश्लेषण माउस, चूहा, और मानव टाप पर किया जा सकता है । यह एक प्रभावी, सस्ती, समय बचाने के लिए प्रसंस्कृत टाप से सेल प्रकार विशेष, बरकरार वास्तुकला परिणामों का आकलन दृष्टिकोण है ।
Introduction
अग्नाशय के आइलेट्स के टाप, परिसंचारी इंसुलिन का एकमात्र स्रोत, मधुमेह का अध्ययन कर रहे जांचकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण ऊतक हैं । किसी भी जीव से, टाप चर आकार, कोशिका प्रकार आवृत्ति, और वास्तुकला1,2,3है । vivo संरचना में अध्ययन करने के लिए पारंपरिक रणनीति और अग्नाशय के अंत में सेल संरचना के टाप अग्न्याशय ऊतक4,5द्वारा है । चूंकि टाप केवल कुल अग्नाशय सेलुलर सामग्री का एक छोटा सा अंश शामिल हैं, आणविक अध्ययन पृथक टाप पर प्रदर्शन कर रहे हैं । पूर्व विवो टाप कल्चरल प्रयोग परीक्षण पोषक तत्वों, जीन मॉडुलन (अभिकर्मक, transduction), या प्रयोगात्मक उपचार के लिए प्रतिक्रिया अंत में स्रावी सेल अस्तित्व, प्रसार, और समारोह मॉडुलन तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान 5 , 6.
Ex वीवो टाप प्रयोगों में प्रायः पूरे टाप या ऊतकवैज्ञानिक या monolayer५,६में उगाई गई टाप कोशिकाओं के आणविक अध्ययनों का आणविक अध्ययन का उपयोग कर विश्लेषण किया जाता है. पूरे टाप के आणविक विश्लेषण के लिए मिश्रण कोशिका प्रकार है, जो झूठी नकारात्मक या झूठी सकारात्मक परिणाम जब किसी भी व्यक्ति को सेल प्रकार के लिए extrapolated उत्पादन कर सकते है की गंभीर चेतावनी परिचय । पद के लिए coverslips पर सेल फैलाव-संस्कृति माइक्रोस्कोपी सेल प्रकार के विशिष्ट परिणाम माप की अनुमति देता है, लेकिन बाधित टाप वास्तुकला, जो हस्तक्षेप और वास्तुकला से संबंधित परिणामों की precludes पहचान के लिए प्रतिक्रिया को बदल सकता है । इसके अलावा, आम तौर पर केवल एक ही परिणाम मापा जा सकता है; उदाहरण के लिए, बीटा सेल प्रसार और एक ही स्थिति के तहत बीटा सेल मौत को मापने के लिए, दो अलग प्रयोगों प्रदर्शन करने की आवश्यकता है । इन दृष्टिकोण भी अंतर-टाप परिवर्तनशीलता, क्षेत्र में रुचि बढ़ाने का एक क्षेत्र के लिए अंधा कर रहे हैं । सेल-प्रकार विशिष्ट आणविक अध्ययन, या एकल सेल आरएनए अध्ययन के लिए प्रवाह cytometry द्वारा टाप कोशिकाओं छंटाई सुरुचिपूर्ण लेकिन महंगा, समय लेने, ऊतक बहुतायत, वास्तुकला-उंमूलन द्वारा सीमित हैं, और नियमित सेल संस्कृति के विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं 5 , 7. पूरे माउंट immunostained टाप के फोकल इमेजिंग उच्च गुणवत्ता बरकरार वास्तुकला डेटा प्रदान करता है, लेकिन श्रम गहन है, और डेटा प्रत्येक नमूने से प्राप्त एक एकल immunostaining8में पहचाने परिणामों तक ही सीमित है ।
पद-संस्कृति पूरे टाप के उच्च गुणवत्ता वाले तेल वर्गों उत्पंन करने की क्षमता इन चिंताओं के कई पते होंगे । उच्च लागत, कम बहुतायत अद्वितीय आनुवंशिक मॉडल से या मानव अंग दाताओं से टाप ऊतक, या टाप स्थिति पोस्ट vivo या इन विट्रो में प्रयोगात्मक हेरफेर, कीमती हैं । एक ही टाप से एकाधिक आयल सेक्शन प्राप्त करने से एक ही प्रयोग से कई सेल-प्रकार के विशिष्ट, अक्षुण्ण-वास्तुकला विश्लेषणों की अनुमति मिलेगी ।
मौजूदा तकनीक खंड के लिए टाप छर्रों उत्पंन करने के लिए अपूर्ण हैं । प्रोटोकॉल-अनुकूलित agarose एक जलीय कम पिघलने बिंदु जेल है कि व्यापक रूप से प्रसंस्करण ऊतकवैज्ञानिक और छोटे या खंडित ऊतक नमूने है कि9प्रक्रिया के लिए मुश्किल है सहित कोशिकाविज्ञान नमूनों में प्रयोग किया जाता है । एक टाप embedding दृष्टिकोण एक microcentrifuge ट्यूब में agarose में टाप को निलंबित करने के लिए है, सामग्री गोली करने के लिए, आगर प्लग पुनः प्राप्त, फिर प्रक्रिया और10,11के लिए एंबेड करने के लिए । ट्यूब के नीचे से जम नमूना निकालने समय लेने और मुश्किल है, नमूना और व्यक्तिगत चोट के जोखिम के सामयिक विखंडन के लिए अग्रणी है । टाप प्लग की नोक में केंद्रित कर रहे हैं, इस पद्धति से प्राप्त वर्गों में अपर्याप्त टाप वितरण करने के लिए अग्रणी । प्लग के गोल नीचे embedding पेचीदा है कि एक टाप-गरीब क्षेत्र के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है । कुल मिलाकर, इस विधि के परिणामस्वरूप वर्गों में कम उपज और झुरमुट टाप वितरण की ओर जाता है.
इस नई विधि टाप सेक्शन की तैयारी के लिए एक सरलीकृत और बेहतर दृष्टिकोण है । टाप एक छोटी मात्रा में केंद्रित कर रहे है और फिर एक खुर्दबीन स्लाइड की चिकनी सतह पर रखा एक छोटी सी डिस्क के रूप में, एक एकल विमान में टाप के साथ । Histogel-टाप डिस्क बाद में एक छोटा निर्जलीकरण और xylene घुसपैठ प्रोटोकॉल में तेल embedding के लिए कार्रवाई की है । पिछले दृष्टिकोण, जो एक microfuge ट्यूब के तल में टाप ध्यान केंद्रित है, यह भी एक तुलना के रूप में किया जाता है । इस नई तकनीक से प्रति सेक्शन टाप की उपज में सुधार होता है, प्रत्येक सेक्शन में टाप का वितरण होता है, और टाप ब्लॉक्स को कैसेट्स के हस्तांतरण में कम समय लगता है. इस तकनीक को टाप जीव या अंय वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी है अपने मूल ऊतक वास्तुकला में एक नमूना पर कई परिणामों को मापने के द्वारा एक कम बहुतायत ऊतक के उत्पादक उपयोग को अधिकतम करने के इच्छुक ऊतक के छोटे टुकड़े का अध्ययन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह संशोधित जेल-डिस्क-आधारित embedding विधि एक सरल, सस्ता और कुशल तरीका प्रदान करता है, जो प्रति अनुभाग टाप की एक उच्च उपज उत्पन्न करती है । एक फ्लैट कांच की सतह पर जेल डिस्क का निर्माण एक अच्छी तरह से परिभाषित क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृतज्ञता UMass मधुमेह उत्कृष्टता के केंद्र में उपयोगी सलाह और विचार विमर्श के लिए बीटा सेल जीवविज्ञान समूह स्वीकार करते हैं । मानव अग्नाशय टाप आशा के शहर में NIDDK वित्त पोषित एकीकृत टाप डिस्ट्रीब्यूशन प्रोग्राम (IIDP) द्वारा प्रदान की गई । यह काम NIH/NIDDK द्वारा वित्त पोषित किया गया: R01-DK114686 (एलसीए), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) और अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन ग्रांट #1 -15-बी एस-003 (एलसीए) द्वारा Amaranth के आदेश के सहयोग से ।
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
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