Bukspyttkjertelen Holme innebygging parafinsnitt

Summary

Ex vivo bukspyttkjertelen Holme studier er viktig for diabetes forskning. Eksisterende teknikker å studere kulturperler holmer i sin opprinnelige 3-dimensjonale arkitektur er tidkrevende, ineffektive og sjelden brukt. Dette verket beskriver en ny, enkel og effektiv metode for å generere høy kvalitet parafinsnitt av hele kulturperler holmer.

Abstract

Eksperimenter ved hjelp av isolerte bukspyttkjertelen småøyer er viktig for diabetes forskning, men holmer er dyrt og begrensede overflod. Holmer inneholder en mikset-celle befolkningen i en strukturert arkitektur som påvirker funksjonen menneskelige holmer er mye variabel i celle type komposisjon. Gjeldende brukte metoder å studere kulturperler holmer inkluderer molekylære studier utført på hele holmer, lumping ulike Holme celletyper sammen, eller mikroskopi eller molekylære studier på spredt Holme celler, forstyrre Holme arkitektur. For i vivo Holme studier er parafin-embedded bukspyttkjertelen snitting en kraftfull teknikk for å vurdere celle-spesifikke resultater i sine opprinnelige bukspyttkjertelen omgivelser. Studere etter kultur holmer av parafin snitting vil gi flere fordeler: påvisning av flere resultater på samme holmer (potensielt også nøyaktig samme øyene, bruker serielle deler), celle-spesifikk målinger og opprettholde opprinnelig Holme celle-celle og celle-undergrunnen interaksjoner både under eksperimentelle eksponering og for analyse. Men isolerte eksisterende teknikker for innebygging holmer etter kultur er ineffektiv, tidkrevende, utsatt for tap av materiale, og generelt produsere deler med utilstrekkelig Holme tall å være nyttig for kvantifisere resultater. Klinisk patologi er laboratorium cellen blokk forberedelse utilgjengelig og upraktisk for grunnleggende forskningslaboratorier. Vi har utviklet en forbedret, forenklet benk toppen metoden som genererer seksjoner med robust avkastning og distribusjon av holmer. Fast holmer er resuspended i varme histologiske agarose gel og pipetted i en flat plate på en standard objektglass, slik at øyene er distribuert i et fly. Etter standard dehydrering og innebygging, kan 4-5 µm inndelingene (10 +) bli kuttet fra samme Holme blokk. Bruker denne metoden, kan histologiske og immunofluorescent analyser utføres på mus, rotte og menneskelige holmer. Dette er en effektiv, rimelig, tidsbesparende å vurdere celle spesifikk, intakt-arkitektur resultatene fra kulturperler holmer.

Introduction

Bukspyttkjertelen holmer Langerhans, den eneste kilden til sirkulerende insulin, er en kritisk vev for etterforskere studere diabetes mellitus. Fra noen gitt organisme har holmer variabel størrelse, celle type frekvens og arkitektur^1,2,3. Den konvensjonelle strategien å studere i vivo struktur og endokrine celle sammensetning av bukspyttkjertelen holmer er ved snitting bukspyttkjertelen vev^4,5. Siden holmer utgjør bare en brøkdel av bukspyttkjertelen mobilnettet innholdet, utføres molekylære studier på isolerte småøyer. Ex vivo Holme cellekulturer eksperimenter testing respons på næringsstoffer, gi gene modulering (hva, signaltransduksjon) eller eksperimentelle behandlinger viktig innsikt i mekanismer modulerende endokrine celle overlevelse, spredning og funksjon ^{5 , 6}.

Ex vivo Holme eksperimenter er ofte analysert ved hjelp av molekylære studier av hele holmer eller histologiske eller molekylære studier av spredt Holme celler dyrket i monolayer^5,6. Molekylær analyse av hele holmer introduserer den alvorlige påminnelse blander celletyper, som kan gi falsk negativt eller falske positive resultater når extrapolated til en enkelt celle type. Celle spredning på coverslips for post kultur mikroskopi tillater celle spesifikk utfallet måling, men forstyrrer Holme arkitektur, som kan endre svar til intervensjon og utelukker identifikasjon av arkitektur-relaterte resultater. Dessuten, kan vanligvis bare en enkelt utfall måles; for eksempel for å måle beta-celle spredning og beta-celledød under samme vilkår, må to separate forsøk utføres. Disse metodene er også blind for Inter Holme variasjon, et område av økende interesse i feltet. Sortering Holme celler av flowcytometri for celle spesifikk molekylære studier eller encellede RNA studier er elegant men dyre, tidkrevende, begrenset av vev overflod, arkitektur-utrydde, og ikke godt egnet til rutinemessig celle kulturanalyser ^{5 , 7}. AC confocal imaging av hele-mount immunostained holmer gir høy kvalitet intakt-arkitektur data, men er arbeidsintensiv, og data fra hvert utvalg er begrenset til resultater identifiserbar i en enkelt immunostai-⁸.

Muligheten til å generere høy kvalitet parafinsnitt av etter kultur hele holmer ville ta mange av disse bekymringene. Høye kostnader, lav-overflod Holme vev fra unik genetisk modeller eller menneskelig orgel givere eller holmer status innlegg i vivo eller i vitro eksperimentelle manipulasjon, er dyrebare. Få flere parafinsnitt fra samme øyene ville tillate flere celle spesifikk, intakt-arkitektur analyser fra samme eksperiment.

Eksisterende teknikker for å generere Holme pellets snitting er ufullkomne. Histology-optimalisert agarose er en vandig lavt Smeltepunkt gel som er mye brukt i behandling av histologiske og fargemaskin prøver inkludert lite eller for fragmentert vevsprøver som er vanskelige å prosessen⁹. En Holme innebygging tilnærming er å suspendere øyene i agarose i et microcentrifuge rør, virvel å pellets materialet, hente agar pluggen, deretter behandle og legge til snitting^10,11. Utdrager befestet prøven fra bunnen av røret er tid forbruker og vanskelig, fører til sporadisk fragmentering av prøven og risiko for personskader. Øyene er konsentrert i spissen av pluggen, fører til utilstrekkelig Holme distribusjon i delene fra denne metoden. Rundt bunnen av kompliserer innebygging slik at en Holme-fattig region kan bli presentert snitting. Total, denne metoden fører til lav avkastning og klumpet seg Holme fordelingen i de resulterende delene.

Denne nye metoden er en forenklet og forbedret tilnærming for utarbeidelse av Holme deler. Holmer er konsentrert i små og deretter plassert på glatte overflaten av en microscope skyve å danne en liten plate, med øyene et enkelt fly. Histogel-Holme platen behandles deretter for parafin innebygging i en forkortet dehydrering og xylen infiltrasjon protokollen. Den forrige fremgangsmåten, som konsentrerer øyene bunnen av et microfuge rør, utføres også som en sammenligning. Denne nye teknikken forbedrer avkastningen av holmer per seksjon, distribusjon av holmer i hver del, og tar mindre tid å overføre Holme blokkene til kassetter. Denne teknikken er nyttig for Holme biologer eller andre forskere studere små biter av vev som ønsker å maksimere produktiv bruk av en lav-overflod vev ved å måle flere resultater på en enkelt prøve i sin innfødt vev arkitektur.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av UMass medisinsk skolen institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. Menneskelige Holme studier ble fastsatt av UMass institusjonelle gjennomgang styret å ikke kvalifiserer IRB eller fritak fordi de ikke involverer bruk av mennesker. 1. Holme isolasjon og kultur Isolere holmer og separat fra forurensende exocrine og ductal vev ved hjelp av metoden du velger.Merk: Denne metoden var optimalisert ved hjelp av holmer isolert av coll…

Representative Results

En illustrert skjematisk av trinnene for å klargjøre platen gel er vist i figur 1. Denne gel plate metoden resulterer i parafinsnitt som inneholder et tilstrekkelig antall holmer distribuert i et enkelt fly å tillate meningsfull kvantifisering av resultater. Figur 2 viser lav-forstørrelse bilder av de resulterende delene å illustrere antall holmer fanget per seksjon. Generelt > 35 holmer var synlig i hver inndeling når 250 …

Discussion

Denne endrede gel-disk-baserte innebygging metoden gir en enkel, billig og effektiv måte å generere en høy avkastning av holmer per seksjon. Konstruere gel platen på en flat glassoverflate forenkler spre holmer i en jevn distribusjon over et godt definert område. Spre øyene en flat plate tilbyr fordelen av å plassere mange holmer i flyet delen, optimalisere ytelse og slik at færre holmer skal brukes. Platen tykkelsen kan justeres etter etterforskere behov. Siden flere inndelinger kan oppnås, kan seriell deler av…

Materials

1.5 mL Eppendorf tube	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic Starter Kit	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Low Binding Tip (1000 μL)	Genesee Scientific	24-430
Low Binding Tip (200 μL)	Genesee Scientific	24-412
Low Binding Tip (20 μL)	Genesee Scientific	24-404
Low Binding Tip (10 μL)	Genesee Scientific	24-401
10% Formalin solution	Sigma	HT501128
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Agarose blue beads- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco's PBS	Life technologies	14190-144
Tissue processing cassette	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 tissue processor	Thermo-Shandon LLC
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, INC	2701
Xylene	Fisher Chemical	X5SK-4
Paraffin	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Insulin antibody	DAKO	A0564
Glucagon antibody	Sigma	G2654
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 secondary antibodies	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 secondary antibodies	Life technologies	A11001