Bukspottskörteln Islet inbäddning för Paraffin avsnitt
Summary
Ex vivo bukspottskörteln holme studier är viktiga för diabetesforskning. Befintliga tekniker för att studera odlade holmar i deras infödda 3-dimensionell arkitektur är tidskrävande, ineffektiv och används sällan. Detta arbete beskriver en ny, enkel och effektiv metod för att skapa högkvalitativa paraffin avsnitt av hela odlade holmar.
Abstract
Experiment med isolerade Langerhanska är viktiga för diabetesforskning, men holmar är dyra och begränsade överflöd. Holmar innehåller en blandad cell befolkning i en strukturerad arkitektur som påverkar funktion och mänskliga holmar är allmänt variabel i cellen typ sammansättning. Nuvarande vanliga metoder för att studera odlade holmar inkluderar molekylära studier utförs på hela holmar, bunta disparata islet celltyper tillsammans, eller mikroskopi eller molekylära studier på spridda cellöar, störa holme arkitekturen. För in-vivo studier i holme är paraffin-inbäddat bukspottkörteln snittning en kraftfull teknik för att bedöma-specifika resultat i native bukspottskörteln miljön. Studera efter kultur holmar av paraffin snittning skulle erbjuda flera fördelar: upptäckten av flera utfall på samma holmar (potentiellt även de exakta-samma holmar, använder seriell avsnitt), cell-typ-specifika mätningar och upprätthålla native Islet cell-cell och cell-underskikt interaktioner både under experimentell exponering och för analys. Dock isolerade befintliga tekniker för inbäddning Langerhanska efter kultur är ineffektiva, tidskrävande, benägna att förlust av material, och i allmänhet producera sektioner med otillräcklig holme nummer att vara användbar för att kvantifiera resultat. Klinisk patologi laboratorium för cell-block som förberedelse är otillgängliga och opraktiska för grundläggande forskningslaboratorier. Vi har utvecklat en förbättrad och förenklad bänk-metod som genererar sektioner med robust avkastning och distribution av holmar. Fast holmar är resuspended i varma histologiska agarosgel och pipetteras i en platt skiva på en vanlig glasskiva, sådan att holmarna är fördelade i ett plan. Efter standard dehydrering och inbäddning, kan flera (10 +) 4-5 µm avsnitt skäras från samma holme block. Med den här metoden kan histologiska och Immunofluorescerande analyser utföras på mus, råtta och människa holmar. Detta är en effektiv, billig, tidsbesparande metod att bedöma cell-typ-specifika, intakta arkitektur resultat från odlade holmar.
Introduction
Bukspottkörtelns Langerhanska öar, den enda källan av cirkulerande insulin, är en kritisk vävnad för utredarna studera diabetes mellitus. Från någon viss organism har holmar varierande storlek, cell typ frekvens och arkitektur1,2,3. Den konventionella strategin att studera i vivo struktur och endokrina cellen sammansättning av Langerhanska är av snittning bukspottkörteln vävnad4,5. Eftersom holmar utgör endast en liten del av totala bukspottskörteln cellulära innehåll, utförs molekylära studier på isolerade öar. Ex vivo holme kultur experiment testa svar på näringsämnen, ger gen modulering (transfection, transduktion) eller experimentella behandlingar viktig inblick mekanismer modulerande endokrina cellöverlevnad, spridning och funktion 5 , 6.
Ex vivo holme experiment analyseras ofta med molekylära studier av hela holmar eller histologiska eller molekylära studier av spridda cellöar som odlas i enskiktslager5,6. Molekylär analys av hela holmar introducerar allvarliga förbehållet blandningens celltyper, som kan ge falskt negativa eller falskt positiva resultat när extrapoleras till någon enskild celltyp. Cell spridning på coverslips för efter kultur mikroskopi kan cell-typ-specifika resultat mätning, men stör holme arkitektur, som kan förändra svar på intervention och utesluter identifiering av arkitektur-relaterade resultat. Dessutom kan generellt endast en enda resultatet mätas; exempelvis för att mäta beta cellproliferation och beta celldöd på samma villkor, behöver två separata experiment utföras. Dessa metoder är också blinda för Inter holme variabilitet, ett område av ökande intresse i fältet. Sortering cellöar av flödescytometri för cell-typ-specifika molekylära studier eller encelliga RNA studier är elegant men dyrt, tidskrävande, begränsat av vävnad överflöd, arkitektur-utrota, och inte väl lämpade för rutinmässig cell kultur analyser 5 , 7. confocal avbildning av hela-mount immunostained holmar ger hög kvalitet intakt-arkitektur data, men är arbetsintensivt, och uppgifter som erhålls från varje prov är begränsad till resultat identifieras i en enda immunfärgning8.
Förmågan att generera högkvalitativa paraffin avsnitt av efter kultur hela holmar skulle lösa många av dessa farhågor. Hög kostnad, låg-överflöd holme vävnad från unika genetiska modeller eller mänskliga organdonatorer, eller holmar status post i vivo eller in vitro- experimentell manipulation, är värdefulla. Att få flera paraffin avsnitt från samma holmarna skulle tillåta flera cell-typ-specifika, intakta arkitektur analyser från samma experiment.
Befintliga tekniker för att generera holme pellets för snittning är ofullkomliga. Histologi-optimerade agaros är en vattenlösning låg smältpunkt gel som används mycket i behandlingen av histologiska och cytologiska prover inklusive små eller fragmenterade vävnadsprover som är svåra att processen9. En holme inbäddning strategi är att upphäva holmarna i agaros i en mikrocentrifug rör, Centrifugera pellet materialet, Hämta agar kontakten, sedan bearbeta och bädda för snittning10,11. Utvinna stelnat provet från botten av röret är tidskrävande och svårt, vilket leder till tillfällig fragmentering av provet och risk för personskador. Holmarna är koncentrerade i spets i kontakten, vilket leder till otillräcklig holme distribution i sektioner som erhållits från denna metod. Den runda botten komplicerar inbäddning sådan att en holme-fattig region kan presenteras för snittning. Sammantaget leder denna metod till låg avkastning och klampade holme distribution i de resulterande avsnitten.
Denna nya metod är en förenklad och förbättrad metod för beredning av holme sektioner. Holmar koncentreras i en liten volym och sedan placeras på den släta ytan på ett objektglas att bilda en liten skiva, med kobbar och skär i ett enda plan. Histogel-Holmen skivan bearbetas därefter för paraffin inbäddning i en förkortad uttorkning och xylen infiltration protokoll. Det tidigare synsättet, som koncentrerar kobbar och skär längst ned i ett mikrofugrör, utförs också som jämförelse. Denna nya teknik förbättrar avkastningen av holmar per sektion, fördelningen av holmar i varje avsnitt, och tar kortare tid att överföra holme block till kassetter. Den här tekniken är användbar för holme biologer eller andra forskare som studerar små bitar av vävnad som vill maximera produktiv användning av en låg-överflöd vävnad genom att mäta flera utfall på ett enda prov infödda vävnad arkitektur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifierade gel-skivbaserade inbäddning metoden ger en enkel, billig, och effektivt sätt att generera en hög avkastning av holmar per sektion. Att konstruera gel skivan på en planglas yta underlättar fördelande holmar i en jämn fördelning över ett väldefinierat område. Sprida holmarna i en platt skiva erbjuder fördelen av att placera många holmar i Plant av delar, optimera avkastningen och möjliggör färre kobbar att användas. Skivans tjocklek kan justeras för att möta utredarnas behov. Eftersom flera a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner tacksamt gruppen Beta Cell biologi vid UMass Diabetes Center of Excellence för användbara råd och diskussioner. Mänskliga Langerhanska tillhandahölls av den NIDDK-finansierade integrerad Islet Distribution Program (IIDP) på City of Hope. Detta arbete finansierades av NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) och av American Diabetes Association bevilja nr 1-15-BS-003 (LCA) i samarbete med ordningen på Amarant.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
