Espectrometria de massa folha Spray: Uma técnica de ionização ambiente rápida para avaliar diretamente a metabolitos de tecidos vegetais
Summary
Espectrometria de massa de pulverizador de folha é uma técnica de análise química direta que minimiza a preparação da amostra e elimina a cromatografia, permitindo a detecção rápida de pequenas moléculas de tecidos vegetais.
Abstract
As plantas produzem milhares de pequenas moléculas que são diversas em suas propriedades químicas. Espectrometria de massa (MS) é uma técnica poderosa para a análise de metabólitos da planta porque ele fornece pesos moleculares com alta sensibilidade e especificidade. Spray de folha MS é uma técnica de ionização ambiente onde o tecido de planta é usado para análise química direta via electrospray, eliminando a cromatografia do processo. Esta abordagem de metabólitos de amostragem permite uma grande variedade de classes químicas para ser detectado simultaneamente de tecidos vegetais intactos, minimizando a quantidade de preparação de amostra necessária. Quando usado com uma MS em massa de alta resolução, precisas, spray de folha MS facilita a rápida detecção de metabólitos de interesse. Também é possível coletar dados de fragmentação de massa em tandem com esta técnica para facilitar a identificação de compostos. A combinação de medições precisas em massa e a fragmentação é benéfica em confirmando identidades compostas. O spray de folha técnica MS requer apenas pequenas modificações a uma fonte de ionização de nanospray e é uma ferramenta útil para expandir ainda mais os recursos de um espectrômetro de massa. Aqui, o tecido de folhas frescas de Sceletium tortuosum (Aizoaceae), uma planta medicinal tradicional da África do Sul, é analisado; numerosos alcaloides de mesembrine são detectados com spray de folha MS.
Introduction
As plantas contêm uma grande variedade de pequenas moléculas com propriedades químicas diferentes. MS é uma técnica poderosa para analisar compostos de plantas, porque pode fornecer composições elementares com uma alta sensibilidade e especificidade para a detecção e identificação de metabólitos1. Mais comumente, MS é realizada em amostras extraídas por meio de solvente, que são separadas por cromatografia antes o MS análise1. No entanto, o uso de cromatografia líquida (LC) requer vezes análise longa e é frequentemente associado com uma amostra extensa preparação1. Em contraste, direto de análise química de tecidos intactos que contorna a cromatografia é uma técnica muito rápida, exigindo a amostra mínima preparação2. Assim, em casos onde as etapas cromatográficas podem ser cobradas, uma análise química direta pode ser altamente vantajosa.
LC-MS típico para pesquisa de produtos e metabolomics natural depende de extrações demoradas em massa de materiais secos ou congelados planta contendo vários tecidos e células tipos3. Alternativamente, análise química direta, tais como a detecção de MS de metabolitos do tecido de planta, pode isolar os tipos de células e evitar artefatos de preparação4. Spray de folha MS, também conhecida como tecido-pulverizador5,6, é uma técnica de ionização ambiente direto MS, que requer essencialmente, sem preparação amostra5,7. Pulverizador de folha que MS está intimamente relacionada com spray de papel MS, uma técnica de ionização ambiente com características de ionização electrospray que permite a detecção dos analitos que são depositadas em papel7. Apesar do nome, folha spray MS é aplicável para vários tipos de tecidos vegetais, não nos deixa e tem sido demonstrado em frutos, sementes, raízes, tecidos florais e tubérculos, entre outros,6,8,9, 10,11,12. A técnica facilita a ionização de fitoquímicos endógenas directamente a partir dos materiais de planta para o espectrômetro de massa para a deteção de8. Spray de folha MS também pode fornecer informações sobre a distribuição espacial dos produtos químicos em tipos diferentes de tecidos em plantas13. Quando o pulverizador folha MS é comparado com a extração de solvente e LC-MS, os resultados sugerem pulverizador folha que MS permite a rápida detecção de metabólitos de superfície de tipos de células únicas tais como tricomas13. A Figura 1 ilustra a montagem experimental de folha pulverizador MS. Ionização electrospray direta ocorre após apenas modificações de fonte menor. Uma alta tensão é aplicada no tecido vegetal através de uma pinça de metal, produzindo um spray de gotas altamente carregadas, formando um cone de Taylor que transporta os íons para a entrada de iões de Electrospray a Sra. ionização ocorre a partir do líquido natural da planta ou o solvente appl IED para a superfície da planta. Uma ponta pontiaguda no tecido facilita a electrospray e pode ser naturalmente natural ou criado por um corte.
Spray de folha MS é um método rápido de análise qualitativa e semi-quantitativa de tecidos de planta intacta que achei utilidade para uma ampla variedade de aplicações. Por exemplo, a técnica tem sido usada para detectar compostos endógenos para distinguir espécies relacionadas e até mesmo para avaliar alterações na mesma espécie cultivada em diferentes condições. Estudos anteriores mostraram esta abordagem medindo metabolitos em beautyberry (Callicarpa L.) 12 e ginseng americano (Panax quinquefolium L.) 6. no último exemplo, ginsenósidos, aminoácidos e oligossacarídeos poderiam ser detectados depois de molhar o tecido cru ginseng. Ginseng americano selvagens e cultivado foram diferenciadas de tubérculo fatias6. Integridade do tubérculo de ginseng foi preservada sucedendo spray de folha MS, que permitiu uma inspeção morfológica e microscópico subsequente6. Além disso, compostos exógenos em amostras de plantas também podem ser detectados. Um número de pesticidas (acetamipride, Difenilamina, imazalil, linurão e tiabendazol) foram detectado na casca ou polpa de frutas e legumes9. Enquanto estes estudos e muitos outros têm mostrado a utilidade do pulverizador folha MS para várias finalidades específicas, um protocolo detalhado não foi anteriormente relatado.
Aqui, a descrição do protocolo não incidirá sobre a otimização do método para um determinado tecido ou composto. Em vez disso, a detecção de alcaloides de mesembrine de Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (Aizoaceae) é usada como um exemplo para discutir as medidas necessárias de otimização que devem ser tomadas ao preparar um experimento de MS de pulverizador de folha para uma espécie, tecido, ou Compound(s) pela primeira vez. S. tortuosum é uma suculenta endêmicas para a região semi-árida de Karoo, na África do Sul. Uma medicina tradicional de San e Khoi Khoi povos, foi usada para supressão apetite e sede, bem como quanto aos seus efeitos psicotrópicos e analgésicos14,15. Atualmente, os extratos padronizados são utilizados para o tratamento de distúrbios neuropsiquiátricos e neuropsicológicos16,17. Os principais compostos de interesse incluem o alcaloide mesembrine e seus derivados, muitos dos quais também são encontrados em relacionados Sceletium espécies15. Populações selvagens e cultivadas de S. tortuosum têm concentrações variáveis de alcaloides mesembrine, apresentando, assim, um desafio de controle da qualidade18. Um método para a detecção rápida de mesembrine alcaloides, tais como spray de folha MS, pode ser útil na monitorização Sceletium produtos. Porque anteriormente, não tinha havido nenhum protocolo experimental visual pormenorizado pelo spray de folha técnica do MS, nós ilustraremos o método usando o exemplo da S. tortuosum, e é descrita a seguir: a modificação de uma fonte de nanospray, o seleção e preparação dos tecidos da planta, a aquisição dos dados, a interpretação dos resultados e a otimização dos parâmetros de MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
O uso bem sucedido do presente protocolo baseia-se sobre a otimização de várias etapas para as espécies de plantas, tipo de tecido e compound(s) de alvo de interesse. Os parâmetros descritos no protocolo fornecem um bom ponto de partida. As seguintes decisões experimentais precisam ser feitas e testadas: ou não para uso (1) corte ou tecido sem cortes e (2) solventes ou sem solvente, (3) o solvente para usar e em que volume, (4) qual a distância do tecido a partir da entrada do íon deve ser e (5) a amplitude de t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela concessão do programa de pesquisa de genoma de planta NSF IOS-1238812 e a sociedade pós-doutorado em biologia IOS-1400818. O trabalho também foi financiado por uma bolsa de pós-graduação aluno de Monsanto para Katherine A. Sammons. O africano pesquisador Fulbright Scholars Program (2017-2018) é agradeceu por financiamento concedido a Nokwanda P. Makunga. Agradecemos imensamente a doação de uma fonte de nanospray de Jessica Prenni e a proteómica e metabolómica facilidade na Colorado State University.
Materials
| Conn Pin | Digi-Key elctronics | WM2563CT-ND | pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage |
| small clamp | Digi-Key elctronics | 314-1018-ND | CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A |
| large clamp | Digi-Key elctronics | 290-1951-ND | ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A |
| Heat shrink | Digi-Key elctronics | Q2Z1-KIT-ND | to cover soldering joints |
| NSI source Nanospray Ion Source | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Tune Software | Thermo scientific | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument | |
| Xcalibur Software | Thermo scientific | ||
| Plant of interest – S. tortousum |
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