एक तापमान ढाल परख Drosophila लार्वा के थर्मल वरीयताओं का निर्धारण करने के लिए
Summary
यहां, हम एक सतत थर्मल ढाल का उपयोग Drosophila लार्वा के पसंदीदा पर्यावरण के तापमान का निर्धारण करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।
Abstract
फल मक्खी, Drosophila melanogasterसहित कई जानवरों, पर्यावरण के तापमान में मिनट मतभेद है, जो उन्हें अपने पसंदीदा थर्मल परिदृश्य बाहर की तलाश करने के लिए सक्षम बनाता है भेदभाव करने में सक्षम हैं । एक परिभाषित रैखिक सीमा से अधिक लार्वा का तापमान वरीयताओं को परिभाषित करने के लिए, हम एक तापमान ढाल का उपयोग परख विकसित की है । एक एकल दिशात्मक ढाल स्थापित करने के लिए, दो एल्यूमीनियम ब्लॉकों स्वतंत्र जल स्नान से जुड़े हैं, जिनमें से प्रत्येक व्यक्तिगत ब्लॉकों के तापमान को नियंत्रित करता है । दो ब्लॉकों में ढाल की निचली और ऊपरी सीमाएं निर्धारित हैं । तापमान ढाल दो पानी नियंत्रित ब्लॉक इतना है कि प्लेट उन दोनों के बीच दूरी तक फैले पर एक agarose लेपित एल्यूमीनियम प्लेट रखकर स्थापित किया गया है । एल्यूमीनियम थाली कि पानी ब्लॉकों के शीर्ष पर सेट है के सिरों को ंयूनतम और अधिकतम तापमान को परिभाषित करता है, और क्षेत्रों में दो ब्लॉकों के बीच एक रैखिक तापमान ढाल फार्म । ढाल परख अलग उंर के लार्वा को लागू किया जा सकता है और म्यूटेंट कि प्रदर्शन phenotypes, ऐसे उत्परिवर्तनों टीआरपी चैनलों और opsins, जो तापमान भेदभाव के लिए आवश्यक है एंकोडिंग जीन को प्रभावित करने के साथ उन के रूप में की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
Thermotaxis सबसे अनुकूल शर्तों1,2,3के साथ एक वातावरण का चयन करने के लिए मोबाइल जानवरों द्वारा नियोजित है । यदि जलवायु जरूरत से ज्यादा गर्म या ठंडा है, यह व्यवहार अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, कई जानवरों आरामदायक रेंज में तापमान में बहुत छोटे मतभेदों के प्रति संवेदनशील होते हैं और एक आदर्श तापमान के साथ बाहर परिवेश की तलाश । यह फल मक्खियों के रूप में poikilothermic जीवों के लिए विशेष महत्व का है, जो पर्यावरण के साथ अपने शरीर का तापमान equilibrate । लार्वा thermotaxis पर नजर रखने के लिए परख की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है और Drosophila क्षणिक रिसेप्टर संभावित (टीआरपी) चैनल4,5,6जैसे आणविक सेंसर की भूमिकाओं को स्पष्ट, rhodopsins7,8, और ionotropic रिसेप्टर रिसेप्टर्स (आईआरएस)9, जो विभिन्न तापमान पर्वतमाला से अधिक तापमान संवेदनशीलता के साथ इन जानवरों राज्यसत्ता.
एक दो तरह की पसंद परीक्षण लार्वा6,7में थर्मल वरीयताओं का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है । परख दो अलग तापमान क्षेत्रों की स्थापना जरूरत पर जोर देता है और जानवरों को दूसरे पर एक तरफ का चयन करने की इजाजत दी । दो तरह के विकल्प टेस्ट से परिणाम दमदार हो सकते हैं, खासकर अगर दो विकल्पों के बीच तापमान में अंतर बड़ा हो । इसके अलावा, के बाद से प्रत्येक परख केवल दो समूहों tabulating शामिल है, डेटा एक साधारण वरीयता सूचकांक के रूप में व्यक्त किया जा सकता है । दो तरह की सहजता और सादगी पसंद परख भी आनुवंशिक स्क्रीन के लिए उत्तरदायी हैं । हालांकि, एक प्रमुख सीमा है कि कई प्रयोगों जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती जानवरों के पसंदीदा तापमान स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं ।
एक ढाल परख के लिए एक एकल परख8में पसंदीदा तापमान स्थापित करने का अवसर प्रदान करता है । इसके अलावा, दो तरह के विकल्प परीक्षण के विपरीत, यह पशुओं के एक समूह के वितरण के मूल्यांकन परमिट, जब तापमान की एक सतत श्रृंखला के साथ सामना । एक ढाल परख एक पेट्री पकवान और एक जानवर का उपयोग करता है और अच्छी तरह से व्यक्तिगत पशुओं10के विस्तृत व्यवहार निस्र्पक के लिए अनुकूल है । हालांकि, के बाद से पेट्री व्यंजन गोल कर रहे हैं, तापमान क्षेत्रों के आकार भिंन है और उत्तरोत्तर केंद्र से दूरी के आधार पर छोटे हैं । इसलिए, इस सेटअप आदर्श पशुओं की आबादी का तापमान चयन की निगरानी के लिए नहीं है ।
एक सतत थर्मल ढाल उपकरण है कि अच्छी तरह से लार्वा के समूहों के तापमान वरीयताओं का आकलन करने के लिए अनुकूल है एक आयताकार क्षेत्र को रोजगार और यहां वर्णित है । तंत्र का निर्माण और इकट्ठा करने के लिए सरल है । इसके अलावा, ढाल रैखिक है, और लचीला है, के रूप में यह 10 डिग्री सेल्सियस से ४२ डिग्री सेल्सियस तक बड़े तापमान पर्वतमाला पर thermotaxis का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । परख तेजी से और सरल करने के लिए प्रदर्शन और reproducible डेटा पैदावार है । लार्वा के इष्ट तापमान की रिपोर्ट करने के अलावा, यह एक एकल प्रयोग में एक पूरे रैखिक सीमा से अधिक जानवरों की आबादी की वरीयताओं को पता चलता है । इन फायदों के कारण, यह thermotaxis के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए एक उत्कृष्ट पसंद है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, यह प्रयोग करने के लिए लार्वा की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए कदम उठाने के लिए महत्वपूर्ण है । इनमें पूर्व में मक्खियों को खमीर पेस्ट से युक्त 2-3 डी के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M. नेि (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) और NIAID (1DP1AI124453) से धन द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
References
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