Un'analisi di gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per determinare la temperatura ambientale preferita delle larve di Drosophila utilizzando un gradiente termico continuo.
Abstract
Molti animali, tra cui la Mosca della frutta, Drosophila melanogaster, sono in grado di discriminare minuscole differenze nella temperatura ambientale, che permette loro di cercare il loro paesaggio termale preferito. Per definire le preferenze di temperatura delle larve in un definito intervallo lineare, abbiamo sviluppato un’analisi usando un gradiente di temperatura. Per stabilire un gradiente di singolo-direzionale, due blocchi di alluminio sono collegati ai bagni di acqua indipendenti, ognuno dei quali controlla la temperatura dei singoli blocchi. I due blocchi impostare i limiti superiori e inferiori della sfumatura. Il gradiente di temperatura viene stabilito dall’immissione una piastra di alluminio rivestite su agarosio sopra i due blocchi d’acqua controllato in modo che la piastra si estende la distanza tra di loro. Le estremità della piastra in alluminio che è situato in cima ai blocchi d’acqua definisce le temperature minime e massime, e le regioni-tra i due blocchi formano una sfumatura lineare di temperatura. Il dosaggio di sfumato può essere applicato alle larve di diversa età e può essere utilizzato per identificare i mutanti che presentano fenotipi, come quelli con mutazioni a carico di geni che codificano per canali TRP e opsine, che sono necessari per la discriminazione di temperatura.
Introduction
Termotassi sono impiegato dagli animali mobili per selezionare un ambiente con condizioni più favorevoli1,2,3. Se il clima è troppo caldo o troppo freddo, questo comportamento è vitale per la sopravvivenza. Inoltre, molti animali sono sensibili alle differenze molto piccole di temperatura nella gamma confortevole e cercano un ambiente con una temperatura ideale. Questo è di particolare importanza per gli organismi pecilotermi come mosche della frutta, che equilibrare la loro temperatura corporea con l’ambiente. Saggi per monitorare termotassi larvali sono stati strumentali nell’individuare e chiarire i ruoli di sensori molecolari come Drosophila transitoria potenziale del ricevitore (TRP) canali4,5,6, Rhodopsins7,8e ionotropici recettore recettori (IRs)9, che dotare questi animali con le sensibilità di temperatura negli intervalli di temperatura diversi.
Un test a scelta a due vie fornisce un approccio per lo studio termiche preferenze in larve6,7. L’analisi comporta che istituisce due zone di temperatura distinte e permette agli animali di selezionare un lato rispetto a altro. I risultati dalle prove di scelta bidirezionale possono essere robusti, soprattutto se le differenze di temperatura tra le due opzioni sono grandi. Inoltre, poiché ogni dosaggio comporta tabulando solo due gruppi, i dati possono essere espresso come un indice semplice preferenza. La facilità e la semplicità di analisi scelta bidirezionale sono anche suscettibili di schermi genetici. Tuttavia, una limitazione importante è che molti esperimenti sono necessari per stabilire la temperatura preferita degli animali wild-type o mutanti.
Un’analisi di gradiente offre la possibilità di stabilire la temperatura preferita in una sola analisi8. Inoltre, a differenza del test a scelta a due vie, permette la valutazione della distribuzione di un gruppo di animali, quando si confronta con una serie continua di temperature. Un gradiente test utilizza una capsula di Petri e singoli animali ed è adatto per caratterizzare il comportamento dettagliato dei singoli animali10. Tuttavia, poiché le capsule di Petri sono rotondi, le dimensioni delle zone di temperatura variano e sono progressivamente più piccole a seconda della distanza dal centro. Pertanto, questa configurazione non è ideale per monitorare le selezioni di temperatura delle popolazioni di animali.
Un apparato di gradiente termico continuo che ben si adatta per valutare le preferenze di temperatura dei gruppi delle larve impiega un’arena rettangolare ed è descritto qui. L’apparato è semplice da costruire e assemblare. Inoltre, la sfumatura è lineare ed è flessibile in quanto può essere utilizzato per valutare la termotassi sopra ampi range di temperatura da 10 ° C a 42 ° C. Il dosaggio è rapido e semplice da eseguire e produce dati riproducibili. Oltre a segnalare la temperatura favorita delle larve, rivela le preferenze della popolazione degli animali nel corso di un’intera gamma lineare in un singolo esperimento. A causa di questi vantaggi, è una scelta eccellente per l’identificazione dei geni richiesti per la termotassi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per garantire il successo di questo protocollo, è importante adottare misure per ottenere un numero adeguato di larve per eseguire gli esperimenti. Questi includono pre-alimentazione le mosche in flaconcini contenenti pasta di lievito per 2-3 d migliorare la deposizione delle uova. I flaconcini devono essere collocati in una vaschetta contenente acqua fiale e racchiuso in un sacchetto di plastica trasparente, che mantiene l’umidità del cibo e promuove l’alimentazione efficace dalle larve permettendo l’esposizione a cic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M. è supportato da finanziamenti da nia (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) e il NIAID (1DP1AI124453).
Materials
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
References
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- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
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