En temperaturgradient analysen att bestämma termisk preferenser av Drosophila larver
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att avgöra den Rekommenderad omgivningstemperatur av Drosophila larver med en kontinuerlig termisk gradient.
Abstract
Många djur, inklusive bananflugan, Drosophila melanogaster, klarar av diskriminerande minuten skillnader i omgivningstemperatur, som gör det möjligt för dem att söka sin föredragna termisk landskap. Om du vill definiera temperatur preferenser larverna över ett definierat linjärt område, utvecklat vi ett test med en temperaturgradient. För att upprätta en enda dubbelriktade gradient, är två aluminium block anslutna till oberoende vattenbad, vilka styr temperaturen på enskilda block. De två blocken sätter nedre och övre gränser på toningen. Temperaturlutning etableras genom att placera en agaros-belagd aluminium plattan över två vatten-kontrollerade block så att plattan sträcker sig över avståndet mellan dem. Ändarna av aluminium plattan som ligger på toppen av vatten block definierar de lägsta och högsta temperaturerna och regionerna däremellan två block bildar en linjär temperaturgradient. Gradient analysen kan tillämpas på larver av olika åldrar och kan användas för att identifiera mutanter som uppvisar fenotyper, såsom de med mutationer som påverkar gener som kodar för TRP-kanaler och opsins, som krävs för temperatur diskriminering.
Introduction
Thermotaxis är anställd av mobila djur att välja en miljö med den mest gynnsamma villkor1,2,3. Om klimatet är överdrivet varmt eller kallt, är detta avgörande för överlevnad. Dessutom, många djur är känsliga för mycket små skillnader i temperatur i intervallet bekväma och söka ute omgivningen med en idealisk temperatur. Detta är särskilt viktigt för poikilothermic organismer som bananflugor, som temperera sin kroppstemperatur med miljön. Analyser att övervaka larval thermotaxis har varit avgörande för att identifiera och tydliggöra rollerna för molekylär sensorer såsom Drosophila Transient Receptor Potential (TRP) kanaler4,5,6, rhodopsins7,8, varvid jonkanalkopplad receptor receptorer (IRs)9, förse dessa djur med temperatur känslighet olika temperaturområden.
Ett tvåvägs val test erbjuder en metod för att studera termisk preferenser i larver6,7. Analysen innebär att upprätta två olika temperaturzoner och låter djuren att välja ena över den andra. Resultaten från tvåvägs val tester kan vara robust, särskilt om temperaturskillnaderna mellan de två alternativen är stora. Dessutom, eftersom varje analys innebär tabulering endast två grupper, kan data uttryckas som ett enkelt index. Den lätthet och enkelhet av tvåvägs val analyser kan också bli föremål för genetiska skärmar. En stor begränsning är dock att många experiment är skyldiga att upprätta vildtyp eller muterade djur Rekommenderad temperatur.
En gradient analysen erbjuder möjlighet att fastställa den önskad temperaturen i en enda analys8. Dessutom till skillnad från tvåvägs val testet möjliggör det utvärdering av fördelningen av en grupp djur, när de konfronteras med en kontinuerlig rad temperaturer. En gradient assay använder en petriskål och enskilda djur och är väl lämpad för kännetecknar detaljerad beteendet hos enskilda djur10. Men eftersom petriskålar är runda, storleken på temperaturzoner varierar och kan successivt mindre beroende på avståndet från centrum. Därför är denna inställning inte idealisk för övervakning temperatur valen av populationer av djur.
En kontinuerlig termisk gradient apparat som är väl lämpad att bedöma temperatur preferenser grupper av larver sysselsätter en rektangulär arena och beskrivs här. Apparaten är enkel att konstruera och montera. Dessutom toningen är linjär, och är flexibel, eftersom det kan användas för att bedöma thermotaxis stora temperaturområden från 10 ° C till 42 ° C. Analysen är snabb och enkel att utföra och ger reproducerbara data. Förutom att rapportera gynnade temperaturen av larver, avslöjar det preferenser av befolkningen av djur över ett helt linjär sortiment i en enda experiment. På grund av dessa fördelar är det ett utmärkt val för att identifiera gener som krävs för thermotaxis.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att säkerställa framgången för detta protokoll, är det viktigt att vidta åtgärder för att erhålla ett tillräckligt antal larver att utföra experimenten. Dessa inkluderar före utfodring flugorna i jäst pasta-innehållande injektionsflaskor för 2-3 d att förbättra äggläggning. Injektionsflaskorna måste placeras i ett tråg innehållande vatten flaskor och inneslutna i en genomskinlig plast påse, som bibehåller fukten i maten och främjar effektiv utfodring av larver medan tillåter exponering för…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M. stöds av finansiering från NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) och NIAID (1DP1AI124453).
Materials
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
References
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
- Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
- Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
- Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: a laboratory handbook. , (2005).
