Visualiseren van de interactie tussen het eiwit Qdot-label en Site-specifically gemodificeerde λ DNA op het niveau van één molecuul
Summary
Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interactie door de totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) met behulp van een site-specifically gemodificeerde λ DNA substraat en een Quantum-dot label eiwit.
Abstract
De fluorescentie microscopie heeft grote bijdragen geleverd in de ontrafeling van de mechanismen van complexe biologische processen op het niveau van één molecuul. In één molecuul testen voor de studie van DNA-eiwit interactie, zijn er twee belangrijke factoren ter overweging: de DNA-substraat met voldoende lengte voor gemakkelijk waarneming en labelen van een eiwit met een geschikt fluorescente sonde. 48.5 kb λ DNA is een goede kandidaat voor de DNA-substraat. Quantumdots (Qdots), toestaan als een klasse van fluorescerende sondes, dat lange tijd observatie (minuten tot uren) en kwalitatief hoogwaardige Beeldacquisitie. In deze paper presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interacties op het niveau van de single-molecuul, waarin de voorbereiding van een site-specifically gemodificeerde λ DNA en labelen van een target eiwit met streptavidine beklede Qdots. Voor een proof of concept, wij kiezen voor ORC (oorsprong erkenning complexe) in ontluikende gist als een proteïne van belang en visualiseren de wisselwerking daarvan met een ARS (autonoom replicerende sequence) met behulp van TIRFM. Vergeleken met andere tl sondes, Qdots hebben duidelijke voordelen in één molecuul studies als gevolg van de hoge stabiliteit tegen photobleaching, maar hierbij moet worden opgemerkt dat deze eigenschap de toepassing ervan in kwantitatieve tests beperkt.
Introduction
Interacties tussen eiwitten en DNA zijn essentieel voor vele complexe biologische processen, zoals DNA-replicatie, DNA-reparatie en transcriptie. Hoewel conventionele benaderingen licht op de eigenschappen van deze processen werpen hebben, zijn vele belangrijke mechanismen zijn nog onduidelijk. Onlangs, met de zich snel ontwikkelende enkel molecuul technieken, sommige van de mechanismen zijn geadresseerd1,2,3.
De toepassing van single-molecuul fluorescentie microscopie op het visualiseren van eiwit-DNA interacties in real-time voornamelijk hangt af van de ontwikkeling van fluorescentie detectie en fluorescerende sondes. Voor de studie van een enkel molecuul is het belangrijk om de proteïne van belang van een label met een geschikt fluorescente sonde aangezien fluorescentie detectiesystemen meestal commercieel beschikbaar zijn.
Fluorescerende eiwitten worden vaak gebruikt in moleculaire biologie. Echter beperken de lage fluorescerende helderheid en stabiliteit tegen photobleaching de toepassing ervan in veel enkel molecuul testen. Quantumdots (Qdots) zijn kleine lichtgevende nanodeeltjes4. Vanwege hun unieke optische eigenschappen, Qdots zijn 10 – 20 keer helderder en verscheidene duizend keer meer stabiel dan de gebruikte organische kleurstoffen5. Bovendien hebben de Qdots een grote Stokes shift (het verschil tussen de positie van excitatie en emissie pieken)5. Dus, is dat de Qdots kan worden gebruikt voor lange tijd waarneming (minuten tot uren) en verwerving van beelden met hoge signaal-ruis verhoudingen, terwijl ze kunnen niet worden gebruikt in de kwantitatieve tests.
Tot op heden zijn er twee benaderingen van label een doel eiwit met Qdots site-specifically: labelen met behulp van Qdot-geconjugeerde primaire of secundaire antilichamen6,7,8; of het doel-eiwit met Qdots direct, dat is gebaseerd op de sterke wisselwerking tussen Biotine en daar9,10,11,12,13te labelen. Daar beklede Qdots zijn commercieel verkrijgbaar. In onze recente studie site-specifically biotinyleerd eiwitten in de ontluikende gist met hoge efficiëntie werden gezuiverd door co-overexpressie van BirA en Avi-gelabelde proteïnen in vivo10. Door het volgende en het optimaliseren van de single-molecuul testen14,15,16,17, nageleefd wij de interacties tussen Qdot-geëtiketteerden eiwitten en DNA op de enkel molecuul niveau met behulp van TIRFM10.
Hier, we kiezen de ontluikende gist oorsprong erkenning complexe (ORC), die kan worden specifiek herkend en binden aan de autonoom replicerende volgorde (ARS), als onze proteïne van belang. Het volgende protocol presenteert een stapsgewijze procedure voor het visualiseren van de interactie van Qdot-label ORC met ARS met behulp van TIRFM. De voorbereiding van het site-specifically gemodificeerde DNA substraat, de biotinylation van DNA, het dekglaasje aan schoonmaken en functionalization, de vergadering van de stroom-cel en de single-molecuul beeldvorming worden beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een protocol om te zien hoe de interactie tussen het eiwit Qdot-label en het DNA van de site-specifically gemodificeerde λ met behulp van de TIRFM in een flow-cel. De noodzakelijke stappen omvatten site-specific wijziging van DNA substraat, DNA biotinylation dekglaasje aan schoonmaken en functionalization, stroom-cel voorbereiding en single-molecuul imaging. Er zijn twee cruciale aandachtspunten die dient te worden opgemerkt. Ten eerste, al de stappen met λ DNA moeten zachtjes worden gemanipuleerd o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Hasan Yardimci en Dr.Sevim Yardimci van het Francis Crick Instituut voor soort helpen in de single-molecuul experimenten, Dr. Daniel Duzdevich van Dr. Eric C. Greene’s lab van Columbia University, Dr. Yujie Sun van de Universiteit van Peking en Dr. Chunlai Chen van Tsinghua Universiteit voor nuttige discussie. Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS interdisciplinaire innovatie Team en de Newton geavanceerde Fellowship (NA140085) van de Royal Society.
Materials
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25×36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25×36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of transcriptional bursting in bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
