להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ו- DNA λ ששונה Site-specifically ברמת מולקולה בודדת
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה (TIRFM) באמצעות מצע DNA λ ששונה site-specifically נקודה קוונטית הנקרא חלבון.
Abstract
מיקרוסקופיה קרינה פלואורסצנטית תרם תרומות גדול בניתוח במנגנונים של תהליכים ביולוגיים מורכבים ברמת מולקולה בודדת. מולקולה בודדת מבחני ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א, ישנם שני גורמים חשובים עבור שיקול: המצע DNA עם אורך מספיק עבור תיוג חלבון גשש פלורסנט מתאימים ופיקוח קל. 48.5 kb λ DNA הוא מועמד טוב המצע הדנ א. נקודות קוונטיות (Qdots), כמחלקה של הגששים פלורסנט, מאפשרים התבוננות ותיק (דקות עד שעות) ו ייבוא תמונות באיכות גבוהה. בנייר זה, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א ברמת מולקולה בודדת, הכוללת הכנת λ ששונה site-specifically DNA, תיוג חלבון המטרה עם מצופים streptavidin Qdots. עבור הוכחת הרעיון, נוכל לבחור אורק (זיהוי מקור מורכבים) בניצני שמרים כמו חלבון עניין והמחש ביחסיו עם ארס (רצף באופן עצמאי שכפול) באמצעות TIRFM. לעומת אחרים הגששים פלורסנט, Qdots יש יתרונות ברורים במחקרים מולקולה בודדת בשל עמידותו גבוהה נגד photobleaching, אך ראוי לציין כי מאפיין זה מגביל את היישום שלה במבחני כמותית.
Introduction
אינטראקציות בין חלבונים ודנ א חיוניים רבים תהליכים ביולוגיים מורכבים, כגון שכפול ה-DNA, DNA לתקן שעתוק. למרות גישות קונבנציונליות יש לשפוך אור על המאפיינים של תהליכים אלה, מנגנונים מרכזיים רבים עדיין אינם ברורים. לאחרונה, עם טכניקות מולקולה בודדת המתפתחת, חלקם של המנגנונים היו כשהיא ממוענת1,2,3.
היישום של מולקולה בודדת פלורסצנטיות מיקרוסקופ על להמחיש בעיקר אינטראקציות חלבון-DNA בזמן אמת תלויה ההתפתחות של זיהוי קרינה פלואורסצנטית וזונדים פלורסנט. עבור מחקר מולקולה בודדת, חשוב לה תווית החלבון עניין גשש פלורסנט מתאים מאחר ומערכות גילוי פלורסצנטיות הם בעיקר זמינים מסחרית.
פלורסנט חלבונים משמשים בביולוגיה מולקולרית. עם זאת, הבהירות פלורסנט נמוך ויציבות נגד photobleaching להגביל את היישום שלה במבחני מולקולה בודדת רבים. נקודות קוונטיות (Qdots) הם זעיר פולט-אור חלקיקים4. בשל תכונותיהם אופטי ייחודי, Qdots בהירים 10 – 20 פעמים, מספר אלפי פעמים יציב יותר מאשר בשימוש נרחב אורגניים צובעת5. יתר על כן, Qdots יש גדולים סטוקס shift (ההפרש בין המיקום של פסגות עירור, פליטה)5. לכן, ניתן להשתמש Qdots תצפית ותיק (דקות עד שעות), רכישת תמונות עם יחס אות לרעש גבוה, בזמן שהם לא יכול להיות מנוצל על מבחני כמותית.
עד כה, ישנן שתי גישות לתייג את חלבון המטרה עם Qdots site-specifically: תיוג בסיועם של7,6,Qdot מצומדת ראשית או משנית של נוגדנים8; או תיוג היעד החלבון עם Qdots ישירות, אשר מבוססת על האינטראקציה חזקה בין ביוטין ו streptavidin9,10,11,12,13. מצופים Streptavidin Qdots זמינים מסחרית. במחקר האחרון שלנו, site-specifically biotinylated חלבונים בניצני שמרים עם יעילות גבוהה היו מטוהרת על-ידי co-ביטוי של בירה וחלבונים מתויג אבי in vivo10. על ידי16,1715,14,מבחני יחיד מולקולה הפעולות הבאות ואופטימיזציה, ראינו את האינטראקציות בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ודנ א-באמצעות רמת מולקולה בודדת TIRFM10.
כאן, אנו בוחרים את ניצני שמרים מקור זיהוי מורכבים (ORC), אשר ניתן באופן ספציפי לזהות, לאגד הרצף באופן עצמאי שכפול (ARS), כמו שלנו חלבון עניין. הפרוטוקול הבא מציג הליך שלב אחר שלב של ויזואליזציה האינטראקציה של התווית על-ידי Qdot אורק עם ארס של שימוש TIRFM. הכנת המצע דנ א שונה site-specifically, biotinylation את ה-DNA, הניקוי coverslip functionalization, את מכלול תאי זרימה ואת ההדמיה מולקולה בודדת מתוארים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבחון את האינטראקציה בין החלבון התווית על-ידי Qdot ה-DNA λ site-specifically ששונתה באמצעות TIRFM בתא-זרימה. הצעדים הנדרשים כוללים שינוי בייעודי לאתר של DNA המצע, דנ א biotinylation, coverslip ניקוי functionalization, זרימה-תא הכנה ואני הדמיה מולקולה בודדת. ישנן שתי נקודות מפתח יש לציין. ראשית, כל ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר חסן Yardimci, Dr.Sevim Yardimci של פרנסיס קריק המכון סוג לעזור בניסויים מולקולה בודדת, ד ר דניאל Duzdevich מהמעבדה של ד ר אריק ג גרין של אוניברסיטת קולומביה, ד ר שמש Yujie באוניברסיטת פקין, ד ר צ’ן Chunlai של באוניברסיטת צינג לדיון שימושי. מחקר זה נתמך על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין 31371264, 31401059, צוות החדשנות הבינתחומי CAS ואחווה את ניוטון מתקדם (NA140085) של החברה המלכותית.
Materials
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25×36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25×36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of transcriptional bursting in bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
