فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة
Summary
تقدم هذه المقالة طريقة التزاوج القائم لتسهيل فحص أوفيريكسبريشن في مهدها الخميرة استخدام مكتبة صفت بلازميد.
Abstract
الخميرة مهدها قد استخدمت على نطاق واسع كنموذج لدراسة البروتينات المرتبطة بالأمراض التي تصيب الإنسان. الفحص الوراثي على نطاق الجينوم أداة قوية التي يشيع استخدامها في الدراسات الخميرة. التعبير عن عدد من البروتينات المرتبطة بأمراض الأعصاب في الخميرة الأسباب سيتوتوكسيسيتي وتشكيل التجميعية، ولخص النتائج في المرضى الذين يعانون من هذه الاضطرابات. هنا، يمكننا وصف طريقة لفحص نموذج خميرة من البروتين المرتبط بالتصلب العضلي الجانبي فوس لمعدلات سميته. بدلاً من استخدام التحويل، هذا البرنامج فحص جديدة تعتمد على التزاوج من الخميرة لإدخال لمكتبة أراييد من البلازميدات في نموذج الخميرة. يحتوي الأسلوب على التزاوج اثنين من مزايا واضحة: أولاً، أنها ذات كفاءة عالية؛ ثانيا، يمكن تخزين مكتبة والبلازميدات arrayed قبل تحويلها للطويلة الأجل أسهم والغليسيرول وتطبيقها بسرعة على شاشات أخرى دون أن الخطوة كثيفة العمالة للتحول إلى نموذج الخميرة في كل مرة. ونحن تثبت كيف يمكن أن تستخدم هذا الأسلوب بنجاح على الشاشة للجينات التي تعديل سمية فوس.
Introduction
مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae كانت تستخدم على نطاق واسع في البحوث العلمية الأساسية1 فهم العمليات الخلوية التي تتصل مباشرة بالأمراض التي تصيب الإنسان. وعلاوة على ذلك، قد استخدمت ككائن نموذج لدراسة البروتينات البشرية المرتبطة بالمرض، مثل تلك المرتبطة بأمراض الأعصاب الأكثر شيوعاً، بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض هنتنغتون والجانبي الضموري 2من التصلب الجانبي (المرض). ميزة نموذج الخميرة هو السهولة التي يمكن أن يؤديها شاشة على نطاق الجينوم لتحديد المسارات الخلوية المتصلة بسمية البروتينات ذات الصلة بالمرض، مما يعطي نظرة ثاقبة إليه سميتها. شاشة واحدة من هذا القبيل يطلق على شاشة مكتبة overexpression، فيه كل من جينات الخميرة 5,500 في مكتبة أراييد تتحول إلى نموذج خميرة على تحديد الجينات التي يمكن تعديل السمية عند أوفيريكسبريسيد. هذا أسلوب الفرز قد طبقت بنجاح في نماذج الخميرة متعددة الأعصاب المرتبطة بالمرض البروتينات، بما في ذلك هونتينجتين لمرض هنتنغتون3، α-سينوكلين لمرض باركنسون4،5 ، Aβ6من مرض الزهايمر، وفوس، ماساتشوستس-43 للمرض7،،من89. الخطوة كثيفة العمالة أكثر من الشاشة على حدة في حين أنه يتم عادة في طريقة الفائق10، هو تحويل جينات الخميرة 5,500 من مكتبة أراييد. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة في كل مرة يتم تكرار الفحص، وكلما نموذجا خميرة المنشأة حديثا تحتاج إلى دراسة. من المهم إيجاد وسيلة أكثر كفاءة لإنجاز هذه المهمة.
[ستبلى] يمكن أن توجد خلايا الخميرة في أشكال فرداني والنباتات على حد سواء. هناك نوعان من المقابلة للتزاوج أنواع الخلايا فرداني، يزاوج نوع والخلايا α. فرداني للتزاوج كل نوع تنتج وتفرز فرمون التزاوج المحددة الخاصة بهم، التي تستجيب فقط الخلايا نوع التزاوج المعاكس. وهذا يسمح للتزاوج بين والخلايا α لإنتاج الخلايا ضعفاني مستقرة،/α. هذه العملية هي عفوية وذات كفاءة عالية11. يمكن لنا أن نستفيد من هذه دورة حياة فريدة من نوعها S. cerevisiae لإدخال بلازميد المكتبة. وبشكل أكثر تحديداً، ستحول كل الجينات في مكتبة صفت بلازميد إلى الخلايا فرداني من نوع التزاوج واحد، أي، خلية α. سيتم تخزين هذه الخلايا التي تحتوي على جينات مكتبة ثم والغليسيرول الأسهم في شكل 96-جيدا أراييد. لكل طراز الخميرة التي تحتاج إلى فحص، يمكن إذابة خلايا الخميرة التي تحتوي على جينات مكتبة من المخزون والغليسيرول، ويمكن أن يتم الفحص عن طريق التزاوج مع نموذج الخميرة من اهتمام بالمقابل التزاوج نوع، أينوع التزاوج. هذه الفكرة من استخدام التزاوج للجمع بين اثنين من الجينات في الخميرة ليست جديدة. قد طبقت بنجاح في الخميرة الفائق الفرز الهجين اثنين، فيه بناء طعم (أي، Gal4-الحمض النووي-ملزمة المجال الأنشطار) في نوع التزاوج واحد جمعت عن طريق التزاوج مع بنية بري من مكتبة أراييد 12-غير أن هذه الاستراتيجية لم تطبق ابدأ في عروض مكتبة أوفيريكسبريشن، التي استخدمت دائماً طرق التحويل التقليدية.
قبل إنشاء مختبرنا نموذج خميرة فوس البروتين المرتبط بالمرض7. من خلال الفحص مكتبة أوفيريكسبريشن باستخدام أسلوب التحويل اكتشفنا خمس جينات الخميرة (ECM32، NAM8، SBP1، SKO1، و VHR1) أن إنقاذ سمية فوس عند أوفيريكسبريسيد. وتأكدت هذه النتائج بشكل مستقل مع دراسة مماثلة بآخر مجموعة8. وأبدى hUPF1، homolog الإنسان من ECM32، لاحقاً لقمع السمية في الخلايا العصبية الأولية13 وفي نموذج حيوان من المرض14 كذلك. باستخدام هذه الجينات الخمسة كدليل على المبدأ، علينا أن نبرهن أن الجينات خمس جميع المثل إنقاذ فوس السمية عند إدخالها في نموذج الخميرة فوس بالتزاوج. حيث يمكن تخزينها بشكل دائم في الأسهم والغليسيرول خلايا الخميرة التي تحتوي على جينات مكتبة وإحياء كلما دعت الحاجة، سيتم إزالة هذا الأسلوب القائم على التزاوج خطوة وقتاً طويلاً لتحويل كل مرة المكتبة بحاجة إلى فحص ضد. منذ التزاوج ذات كفاءة عالية بأي تحويل بلازميد المعنية، هذه الاستراتيجية أيضا إلى حد كبير يقلل التكلفة المرتبطة بتنقية وتحويل مكتبة بلازميد كبيرة. سوف نطبق هذا الأسلوب بنجاح إلى مكتبة الفرز ضد الخميرة نموذج فوس.
إجراء الفرز على أساس التزاوج يرد بإيجاز في الشكل 1. في البداية، تتحول إلى سلالة خميرة فرداني من التزاوج α نوع استخدام بروتوكول تحول الفائق خميرة التي يحتوي على كل من لوحة 96-جيدا جيدا الخميرة تحول مع بلازميد مكتبة محددة المكتبة بلازميد صفت. يتم حفظ هذه المجموعة من الخميرة المحولة كمخزون والغليسيرول يمكن إذابة وإحياؤها لاستخدامها في وقت لاحق. نموذج الخميرة من الاهتمام، في هذه الحالة سمية فوس، يجب أن يتم إنشاؤها في سلالة خميرة فرداني مع نوع التزاوج المعاكس (التزاوج نوع). في طريقة الفائق باستخدام معقم 96-دبوس مثاليان، سلالة فوس وسلالات الخميرة التي تحتوي على مكتبة بلازميد يتم تحويلها إلى لوحات 96-البئر الذي يحتوي على الوسائط الغنية، ويسمح لرفيقه. بعد التزاوج، كمية صغيرة من كل بئر الثقافة التزاوج يتم نقلها إلى 96-جيدا لوحات تحتوي على وسائط الإعلام التسرب الاصطناعية في الخميرة مثنوية فقط التي تحتوي على كلا فوس ومكتبة الجينات يمكن أن تنمو. ثم يتم استخدام جهاز اكتشاف روبوتية لنقل الثقافة الخميرة من كل بئر على لوحات أجار فيها فعل التعبير عن فوس والجينات المكتبة. بالإضافة إلى ذلك، رصدت الثقافة الخميرة للتحكم في لوحات أجار حيث فوس والجينات مكتبة لا يعبر عن. في أعقاب النمو على ألواح أجار، سيتم تحديد الجينات التي إنقاذ أو تزيد من حدة سمية فوس.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يمكننا وصف بروتوكولا لأداء شاشة overexpression بلازميد في استخدام التزاوج لإدخال بلازميد المكتبة في نموذج الخميرة الخميرة. باستخدام هذا النهج، يمكن فحص نماذج متعددة من الخميرة سمية البروتين أمراض الأعصاب باستخدام نفس المجموعة من الخميرة تحول مع مكتبة بلازميد. عملية شاقة للتحول يحتاج فقط ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لمناقشات عميقة مع الأعضاء في جو المختبر ومختبر تشونغ، والدعم المالي من جامعة ولاية رأيت.
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker’s yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer’s disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
- Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
- Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
