На основе спаривания гиперэкспрессия библиотека скрининга в дрожжи
Summary
Эта статья представляет метод, основанный на спаривания, для облегчения гиперэкспрессия скрининга в многообещающий дрожжей с использованием библиотеки выстроились плазмиды.
Abstract
Многообещающий дрожжи широко используется как модель в изучении белков, связанные с заболеваниями человека. Генетический скрининг генома общесистемной является мощным инструментом, широко используется в исследованиях дрожжей. Выражение целого ряда нейродегенеративные заболевания связанных белков в дрожжей вызывает цитотоксичности и совокупных формирования, изложив выводы, видел у больных с этими расстройствами. Здесь мы описываем метод для проверки модель дрожжи связанные боковой амиотрофический склероз Белка FUS для модификаторов его токсичности. Вместо преобразования, эта новая платформа скрининга зависит спаривания дрожжей, чтобы внедрить библиотеку выстроились плазмид в модель дрожжей. Спаривания метод имеет две явные преимущества: во-первых, она очень эффективна; Во-вторых, предварительно преобразованные выстроились библиотека плазмиды могут храниться для долгосрочного как глицерин запас и быстро прикладной для других экранов без трудоемкого шаг преобразования в модель дрожжи каждый раз. Мы демонстрируем, как этот метод может успешно использоваться для экран для генов, которые изменяют токсичность FUS.
Introduction
Многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae широко используется в фундаментальных научных исследований1 понять клеточных процессов, непосредственно связанных с заболеваниями человека. Кроме того он был использован в качестве модельного организма для изучения человеческих болезней связанных белков, таких как те связаны с наиболее распространенными нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и амиотрофический Склероз (ALS)2. Преимуществом дрожжевых модели является легкость, с которой геном широкий экран может выполняться для выявления клеточных пути, относящиеся к токсичности белков, связанных с заболеванием, таким образом давая понять механизм их токсичности. Один такой экран называется гиперэкспрессия библиотека экрана, в котором каждый из 5500 дрожжи генов в библиотеку выстроились превращается в модель дрожжи для определения, какие гены могут изменять токсичности при оверэкспрессировали. Этот метод отбора успешно применяется в моделях дрожжи несколько нейродегенеративные заболевания связанных белков, включая гентингтина для болезни Гентингтона3, α-synuclein для болезни Паркинсона4,5 , Значения для болезни Альцгеймера6и Фу и TDP-43 ALS7,8,9. Хотя обычно это делается в манере высок объём10, наиболее трудоемкий этап экрана индивидуально преобразования 5500 дрожжей гены от выстроились библиотеки. Этот шаг должен выполняться каждый раз, когда показ повторяется, и всякий раз, когда модель недавно созданной дрожжи необходимо изучить. Важно найти более эффективный способ для решения этой задачи.
Стабильно дрожжевых клеток может существовать в haploid и диплоидных форм. Существует два противоположных спаривания типы клеток haploid, спаривания типа и α. Haploid клетки каждого спаривания типа производят и выделяют их собственных конкретных спаривания феромонов, которому только напротив спаривания типа клетки реагируют. Это позволяет спаривания между и α клетки для производства стабильных диплоидных клетках, a/α. Этот процесс является спонтанным и высокоэффективных11. Мы можем воспользоваться этой уникальной жизненного цикла S. cerevisiae представить библиотеку плазмиды. Говоря более конкретно каждый ген в библиотеке выстроились плазмиды будет преобразован в haploid клетки одного брачного типа, т.е., α клеток. Эти клетки, содержащие гены библиотека затем будут храниться на складе глицерина в формате выстроились 96-луночных. Для каждой модели дрожжей, который должен быть показан, дрожжевые клетки, содержащие гены библиотеки можно разморозить из глицерина запасов, и скрининга может быть сделано путем спаривания с моделью дрожжи интереса к противоположной спаривания, то есть, спаривания типа type. Эта идея использования спаривания объединить два генов в дрожжи не является новым. Она успешно применялась в высок объём дрожжей, которые скрининг 2 гибрида, в котором приманку (т.е., Gal4-ДНК связывающих домена сплавливания) построить в одном типе спаривания приняли участие путем спаривания с добычей конструкции из выстроились библиотеки 12. Тем не менее, эта стратегия никогда не применялась в гиперэкспрессия библиотека фильмов, которые всегда использовали методы традиционной трансформации.
Наша лаборатория ранее установленные дрожжи модель ALS-связанные Белка FUS7. Через гиперэкспрессия библиотека скрининга с помощью метода преобразования мы обнаружили пять дрожжи генов(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1и VHR1), которые спасти токсичность FUS, когда оверэкспрессировали. Эти выводы были независимо подтверждены с аналогичного исследования другой группы8. hUPF1, человека гомолога ECM32, позднее было показано для подавления токсичности в первичной нейрональные клетки13 и в животной модели ALS14 также. Используя эти пять гены как подтверждение принципа, мы демонстрируем, что все пять гены аналогичным образом спасти FUS токсичности, когда они будут введены в модель дрожжи FUS путем спаривания. Поскольку дрожжи клетки, содержащие гены библиотека может хранятся постоянно на складе глицерина и возродил всякий раз, когда необходимо, этот метод, основанный на спаривание будет удалить времени шаг преобразования каждый раз, когда библиотека должна проверяться против. После спаривания высокоэффективных с без преобразования плазмида участвующих, эта стратегия также существенно снижает затраты, связанные с очищения и преобразования библиотеки большой плазмиды. Мы будем успешно применять этот метод в библиотеке, скрининг против дрожжи модели FUS.
Процедура отбора на основе спаривания кратко описана на рисунке 1. Первоначально выстроились плазмида библиотека превращается в haploid дрожжей спаривания типа α, с помощью протокола преобразования высокой пропускной способностью дрожжи в котором каждой скважины 96-луночных плиты содержит дрожжи преобразована с определенной библиотеки плазмиды. Эта коллекция преобразованные дрожжей сохраняется как глицерин запас, который может быть оттаяла и возродил для использования позже. Дрожжи модель интереса, в данном случае FUS токсичности, должен быть создан в haploid дрожжей с противоположным типом спаривания (спаривания типа). В духе высокой пропускной способности, с помощью стерильных 96-контактный репликаторы штамм FUS и штаммов дрожжей, содержащий библиотеку плазмида переданы 96-луночных пластины, содержащие богатые средства массовой информации и разрешено мат. После спаривания, небольшой объем от каждой скважины спаривания культуры передается 96-луночных пластины, содержащие синтетические отсева СМИ в котором только диплоидных дрожжи, содержащие оба FUS и библиотека гены могут расти. Роботизированная машина пятнистость затем используется для передачи культуры дрожжей от каждой скважины на плиты агара, где индуцируется выражение FUS и библиотека генов. Кроме того дрожжевая культура выставляется для управления где FUS и библиотека гены не выразили плиты агара. После роста на плитах агара будут определены гены, которые спасти или усугубить FUS токсичности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем протокол для выполнения экран гиперэкспрессия плазмида с помощью спаривания представить библиотеку плазмида в модель дрожжей дрожжи. Используя этот подход, несколько моделей дрожжи токсичности белка нейродегенеративные заболевания может проверяться с помощью то?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за вдумчивого обсуждения с членами Ju лаборатория и Лаборатория Чжун и финансовой поддержке Райт государственный университет.
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker’s yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer’s disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
- Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
- Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
