Parring-baserede overekspression bibliotek Screening i gær
Summary
Denne artikel præsenterer en parring-baseret metode for at lette overekspression screening i spirende gær ved hjælp af en klædt plasmid bibliotek.
Abstract
Spirende gær har været meget anvendt som model i at studere proteiner forbundet med sygdomme hos mennesker. Genome-wide genetisk screening er et kraftfuldt værktøj, der er almindeligt anvendt i gær undersøgelser. Udtryk for en række neurodegenerativ sygdom-associerede proteiner i gær forårsager cytotoksicitet og samlede dannelse, recapitulating resultater ses hos patienter med disse lidelser. Her, beskriver vi en metode til screening af en gær model af amyotrofisk Lateral sklerose-forbundet protein FUS for modificering af dets toksicitet. Istedet for benytter transformation, afhængig af denne nye screening platform parring af gær til at indføre en klædt bibliotek af plasmider i gær model. Metoden parring har to klare fordele: for det første er yderst effektiv; andet kan pre transformerede klædt biblioteket af plasmider gemmes for langsigtet som en glycerol bestand, og hurtigt anvendes på andre skærme uden den arbejdskrævende trin af transformation i gær model hver gang. Vi demonstrere, hvordan denne metode kan med succes bruges til at screene for gener, der ændrer FUS toksicitet.
Introduction
Spirende gær Saccharomyces cerevisiae har været meget anvendt i videnskabelig grundforskning1 for at forstå cellulære processer direkte relateret til menneskelige sygdomme. Desuden, det har været brugt som en model organisme, for at studere menneskelig sygdom-associerede proteiner, som dem knyttet til de mest almindelige neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, Huntingtons chorea og Amyotrofisk Lateral sklerose (ALS)2. En fordel ved gær modellen er den lethed, hvormed en genome-wide screen kan udføres for at identificere cellulære veje relateret toksicitet af sygdom-relaterede proteiner, hvilket giver indsigt i mekanismen af deres toksicitet. En sådan skærm kaldes en overekspression Biblioteksskærmen, hvori hver af de 5.500 gær gener i en klædt bibliotek er omdannet til en gær model til at identificere, hvilke gener kan ændre toksicitet når overexpressed. Denne screeningsmetode har været anvendt med succes i gær modeller af flere neurodegenerativ sygdom-associerede proteiner, herunder huntingtin for Huntington’s chorea3, α-synuclein for Parkinsons sygdom4,5 , Aβ for Alzheimers sygdom6, og FUS og TDP-43 for ALS7,8,9. Mens det er normalt gøres i en høj overførselshastighed måde10, er den mest tidskrævende trin af skærmen individuelt omdanne 5.500 gær gener fra en klædt bibliotek. Dette trin skal udføres hver gang screening er gentaget, og når en nyetableret gær model skal undersøges. Det er vigtigt at finde en mere effektiv måde at udføre denne opgave.
Gærceller kan stabilt findes i både haploide og diploide form. Der er to modsatte parring typer haploide celler, parring type en og α. haploide celler af hver parring type producerer og udskiller deres egne specifikke parring pheromone, som kun de modsatte parring type celler reagerer. Dette giver mulighed for parring mellem en og α celler til at producere stabil diploide celler, a/α. Denne proces er spontan og højeffektive11. Vi kan drage fordel af denne unikke livscyklus af S. cerevisiae at indføre plasmid bibliotek. Mere specifikt vil hvert gen i biblioteket klædt plasmid blive omdannet til haploide celler af en parring type, dvs., α celle. Disse celler, der indeholder bibliotek gener gemmes derefter på glycerol lager i en klædt 96-brønds format. For hver gær model, der skal screenes, gærceller indeholdende bibliotek gener kan blive optøet straks fra glycerol lager, og screening kan gøres gennem parring med gær model af interesse i den modsatte parring typen, dvs., parring en. Denne idé om at bruge parring for at samle to gener i gær er ikke ny. Det har været anvendt med succes i høj overførselshastighed gæren to-hybrid screening, hvori en agn konstruere (dvs., Gal4-DNA-bindende domæne fusions) i en parring type er bragt sammen via parring med en bytte konstruktion fra en klædt bibliotek 12. men denne strategi har aldrig været anvendt i overekspression bibliotek screeninger, som altid har brugt traditionel transformation metoder.
Vores laboratorium tidligere konstaterede en gær model af ALS-forbundet protein FUS7. Gennem overekspression bibliotek screening ved hjælp af metoden transformation opdagede vi fem gær gener (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, og VHR1), der redde toksicitet af FUS når overexpressed. Disse resultater blev uafhængigt bekræftet med en lignende undersøgelse af en anden gruppe8. hUPF1, en menneskelig homolog af ECM32, blev senere vist at undertrykke toksicitet i primære neuronale celler13 og i en dyremodel af ALS14 så godt. Ved hjælp af disse fem gener som bevis af princippet, vise vi, at alle fem gener ligeledes redde FUS toksicitet, når de føres ind i FUS gær model af parring. Da gærceller, der indeholder bibliotek gener kan gemmes permanent på glycerol lager og genoplivet efter behov, fjerner denne parring-baseret metode den tidskrævende trin af transformation hver gang biblioteket skal være Afskærmet mod. Da parring er yderst effektiv med ingen plasmid transformation involveret, reducerer denne strategi også betydeligt omkostningerne forbundet med rensning og transformation af et stort plasmid bibliotek. Vi vil med succes anvende denne metode til et bibliotek for screening mod gær model af FUS.
Proceduren for parring-baseret screening er kort beskrevet i figur 1. I første omgang, er klædt plasmid bibliotek omdannet til en haploid gærstamme af parring type α ved hjælp af en høj overførselshastighed gær transformation protokol, hvor hver brønd af en 96-brønd plade indeholder gær omdannet med et bestemt bibliotek plasmid. Denne samling af transformerede gær er gemt som en glycerol bestand, der kan blive optøet og genoplivet til brug senere. Gær model af interesse i denne sag FUS toksicitet, skal oprettes i en haploid gærstamme med den modsatte parring type (parring type en). I en høj overførselshastighed måde ved hjælp af steril 96-pin replikatorer, er FUS stamme og gærstammer indeholdende plasmid bibliotek overført til 96-brønd plader der indeholder rige medier og tilladt at mate. Efter parring, en lille mængde fra hver godt af parring kultur er overført til 96-brønd plader der indeholder syntetiske frafald medier i hvilken kun diploide gær, der indeholder både FUS og bibliotek gener kan vokse. En robot spotting maskine bruges derefter til at overføre gær kultur fra hver brønd på agar plader hvor udtryk for FUS og bibliotek gener er induceret. Derudover er gær kultur plettet for at styre agar plader hvor FUS og bibliotek gener ikke er angivet. Efter vækst på agar plader, vil blive identificeret gener, der redde eller forværre FUS toksicitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskriver vi en protokol for at udføre en plasmid overekspression skærm i gær ved hjælp af parring for at indføre plasmid bibliotek i gær model. Brug denne fremgangsmåde, kan flere gær modeller for neurodegenerative sygdomme protein toksicitet screenes ved hjælp af den samme samling af gær transformeret med plasmidet bibliotek. Den besværlige proces transformation skal kun udføres én gang, efter hvilke højeffektive gær parring bruges til at indføre plasmid bibliotek i forespørgslen stamme. Denne pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for de tankevækkende drøftelser med medlemmer af Ju laboratorium og Zhong laboratorium, og den finansielle støtte fra Wright State University.
Materials
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker’s yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer’s disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
- Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
- Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
