कॉर्निया घाव भरने के लिए एक मॉडल के रूप में आंख गड़गड़ाहट के साथ Corneal उपकला घर्षण
Summary
इस प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करने के लिए माउस की आंख की सतह को एक घर्षण दण्ड, और उसके बाद घाव भरने की प्रक्रिया का पालन करें । प्रोटोकॉल एक आंख गड़गड़ाहट का लाभ लेता है के लिए आंशिक रूप से anaesthetized चूहों में आंख की सतह उपकला हटा दें ।
Abstract
murine कॉर्निया घाव भरने का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करता है । कॉर्निया आंख की सबसे बाहरी परत है, और इस तरह चोट करने के लिए पहली रक्षा है । वास्तव में, आंख की चोट क्लिनिक में पाया का सबसे आम प्रकार एक corneal घर्षण है । यहां, हम एक आंख गड़गड़ाहट का उपयोग करने के लिए एक anesthetized चूहों पर vivo में corneal उपकला को हटाने में जिसके परिणामस्वरूप घर्षण प्रेरित । इस विधि लक्षित और reproducible उपकला व्यवधान के लिए अनुमति देता है, अन्य क्षेत्रों को बरकरार छोड़. इसके अलावा, हम fluorescein धुंधला के साथ abraded उपकला के दृश्य का वर्णन और कैसे abraded कॉर्निया कल्पना करने के लिए पर ठोस सलाह प्रदान करते हैं । फिर, हम घाव भरने की समय रेखा का पालन करें 0, 18, और ७२ एच घर्षण के बाद, जब तक घाव re-epithelialized है । corneal चोट की उपकला घर्षण मॉडल उपकला कोशिका प्रसार, प्रवास और corneal परतों के पुनः epithelialization पर अध्ययन के लिए आदर्श है. हालांकि, इस विधि घाव भरने के दौरान stromal सक्रियण का अध्ययन करने के लिए इष्टतम नहीं है, क्योंकि नेत्र गड़गड़ाहट stromal कोशिका परतों में घुसना नहीं है । इस विधि भी नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, उदाहरण के लिए, दवा प्रभावशीलता के पूर्व नैदानिक परीक्षण.
Introduction
कई अंगों की उपकला परतों चोटों को उजागर कर रहे हैं. हालांकि, वे भी घाव भरने के माध्यम से ऊतक नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति करने की क्षमता होते हैं । कॉर्निया घाव भरने का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करता है । यह आंख की बाहरी सतह रूपों और संवेदनशील नेत्र मशीनरी के लिए एक सुरक्षात्मक परत प्रदान करता है । इस प्रकार, कॉर्निया रोगजनकों और पानी के नुकसान के लिए एक शारीरिक बाधा के रूप में कार्य करता है । यह तीन परतों से बना है; उपकला, स्ट्रोमा और endothelium. कॉर्निया की उपकला कॉर्निया की सबसे बाहरी परत बनाता है । उपकला कोशिकाओं तंग जंक्शनों के माध्यम से एक दूसरे के लिए कड़ाई से पालन करके कॉर्निया के बैरियर समारोह बनाए रखने1,2,3. एक acellular corneal तहखाने झिल्ली, बोमन की झिल्ली, व्यापक स्ट्रोमा है, जो दुर्दम्य keratocytes शामिल से उपकला अलग । स्ट्रोमा के तहत, endothelial कोशिकाओं के पोषक तत्वों, पानी और ऊपरी परत को ऑक्सीजन चैनल ।
Corneal घर्षण क्लिनिक4में बहुत आम हैं । कॉर्निया के लिए चोटों विविध रहे हैं, लेकिन मोटे तौर पर ऐसे धूल या रेत, खरोंच, या अंय विदेशी वस्तुओं के रूप में छोटे कणों की वजह से कर रहे हैं । प्रोटोकॉल यहां वर्णित corneal उपकला घर्षण के एक नैदानिक प्रासंगिक प्रकार reproducing करना है । ऐसा करने में, इस प्रोटोकॉल चिकित्सकों और corneal वैज्ञानिकों के लिए एक नियंत्रणीय और लाभदायक विधि प्रदान करता है अपने अध्ययन में लागू । हम एक सुस्त नेत्र गड़गड़ाहट के साथ ऊतक abrading द्वारा vivo murine कॉर्निया पर चोट की मरंमत परख में एक प्रदर्शन किया है, Algerbrush द्वितीय । यहाँ, हम केवल केंद्रीय corneal उपकला के लिए घर्षण लक्ष्य और नुकसान के बिना अंग के अन्य भागों छोड़. इस प्रकार, प्रोटोकॉल corneal उपकला कोशिका गतिशीलता या फिर से epithelialization के दौरान तहखाने झिल्ली का अध्ययन करने के लिए आदर्श है, सेल प्रवास, प्रसार और vivo5में भेदभाव. हाल ही में, इस मॉडल के लिए murine कॉर्निया में जनक सेल गतिशीलता का विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह के रूप में पुनः में विभेदित corneal उपकला कोशिकाओं की क्षमता का अनावरण करने के लिए उपयोग किया गया corneal6,7चोट के बाद स्टेम सेल आला स्थापना । घर्षण के बाद, कॉर्निया अपने सामांय पारदर्शिता और तंयता ताकत के लिए देता है । दिलचस्प है, इन विट्रो में एक अध्ययन संकेत दिया कि फिर से epithelialization वृद्धि हुई सेल प्रसार8के बिना होता है । इस प्रोटोकॉल murine कॉर्निया में निर्बाध चिकित्सा की समयरेखा का वर्णन । विधि इस प्रकार चिकित्सा पैटर्न और गति पर दवाओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए लागू है ।
कॉर्निया बड़े पैमाने पर घाव भरने के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, कई अध्ययनों ने चोट के दूसरे मॉडलों पर भरोसा जताया है । corneal चोट का एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल alkaline जला है कि सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) के साथ या बिना फ़िल्टर कागज corneal सतह9पर लागू करने के द्वारा किया जाता है । एक बड़े और फैलाना चोट है कि न केवल corneal उपकला को प्रभावित करता है, लेकिन यह भी कंजाक्तिवा और स्ट्रोमा9,10में alkaline जोखिम परिणाम । मजबूत alkaline समाधान corneal अल्सर, opacification, और neovascularization9प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है । भड़काऊ कोशिकाओं स्ट्रोमा आमतौर पर 6 घंटे के भीतर आक्रमण और 24 ज11तक वहां रहते हैं । इस प्रकार, alkaline चोट stromal सक्रियण से संबंधित अध्ययन में एक उचित तरीका है । रासायनिक चोट का एक अंय प्रकार के कॉर्निया9,10पर dimethyl sulfoxide (DMSO) लागू करने से दण्डित किया जा सकता है । अंय आमतौर पर इस्तेमाल किया चोट मॉडल चीरा घाव है कि स्ट्रोमा और keratectomy घावों, जो स्ट्रोमा14,15के ऊपरी हिस्से तक ही सीमित है के माध्यम से घुसना शामिल हैं । इन तरीकों को भी stromal घाव भरने के बारे में सवालों के जवाब उपयोगी हैं । अलग चोट मॉडल अपने स्वयं के फायदे और नुकसान है । घर्षण, या corneal उपकला की दुल्हन, पहले पूर्व vivo कॉर्निया16पर सुस्त नश्तर या ब्लेड का उपयोग कर विकसित किया गया था । इस विधि में बाद में माउस, चूहा, और खरगोश17,18,19,20,21,22पर vivo में उपयोग किया गया है । आंख गड़गड़ाहट का प्रयोग (1 चित्रा), हम उपकला की केवल एक चयनित क्षेत्र को हटाने, अप्रभावित उपकला के बाकी छोड़. इस तरह, यह ठीक कॉर्निया के विभिन्न भागों के लिए उपकला हटाने को लक्षित करने के लिए संभव है. इसके अलावा, घर्षण आकार fluorescein धुंधला के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अलावा, यहां हम चिकित्सा अवधि के दौरान घर्षण बंद का पालन करें ।
इस विधि कई फायदे बन गया, मैं) घर्षण साइट है, जो रासायनिक चोट, द्वितीय के साथ संभव नहीं है की सटीक स्थान सहित) घर्षण प्रदर्शन करने के लिए जल्दी है, और iii) यह गैर इनवेसिव है । इस के साथ साथ, हम एक मॉडल के रूप में नस्ल NMRI माउस का उपयोग कर विधि का वर्णन है, लेकिन यह माउस आनुवंशिक मॉडल के विशाल सरणी के लिए लागू किया जा सकता है, साथ ही साथ चूहे और खरगोश, जो आम मानव corneal व्यवधान का अध्ययन करते थे मॉडल हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
घायल तरीके corneal homeostasis और विकृतियों के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए लोकप्रिय उपकरण हैं । घर्षण मॉडल नेत्र विज्ञान में प्रासंगिक समस्याओं का पता करने के लिए एक अच्छी तरह से नियंत्रित विधि प्रदान कर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उसे अमूल्य तकनीकी सहायता और व्यावहारिक मदद के लिए Kaisa Ikkala शुक्रिया अदा करना चाहूंगा जब इस विधि actualizing के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हमारे केंद्रीय अनुसंधान के सवालों के कार्यांवयन के दौरान पर बाद में । हम यह भी पशु चिकित्सा के काम के दिशा निर्देशों की योजना के साथ उसकी मदद के लिए प्रयोगशाला पशु केंद्र और अंना Meller शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| NMRI mouse | Envigo | 275 | |
| 0.9% NaCl | use sterile | ||
| Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
| Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
| Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
| Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
| Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
| 1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
| Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
| Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
| Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
| Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
| Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
| Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
| Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
| Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
| CO2 chamber | |||
| Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
| Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
| 26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
| 2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
| Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
| Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
| Xylene | VWR | UN1307 | |
| Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
| Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
| Microtome | Microm | HM355 | |
| Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
| Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
| Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |
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