Hornhinnen Epithelial slitasje med okulær Burr som modell for hornhinnen sårtilheling

Summary

Denne protokollen beskriver en metode å påføre en slitasje på okulær overflaten av musen, og følge såret helbredelsesprosessen etter. Protokollen utnytter en okulær burr delvis fjerne overflaten epitel i øyet i anaesthetized mus.

Abstract

Murine hornhinnen gir en utmerket modell for å studere sårtilheling. Hornhinnen er det ytterste laget av øyet, og dermed er den første forsvaret til skade. Den vanligste typen øye skade i klinikken er faktisk en hornhinnen avsliting. Her benytter vi en okulær burr å indusere en slitasje resulterer i fjerning av hornhinnen epitel i vivo på bedøvet mus. Denne metoden gir mulighet for målrettet og reproduserbar epithelial avbrudd, røres andre områder. I tillegg vi beskrive visualisering av abraded epitel med fluorescein flekker og gi konkrete råd om hvordan å visualisere abraded hornhinnen. Deretter følger vi tidslinjen i sårheling 0, 18 og 72 h etter slitasje, inntil såret er re epithelialized. Epitel slitasje modell av hornhinnen skade er ideell for studier av epitelial celle spredning, migrasjon og nytt epithelialization av hornhinnen lag. Denne metoden er imidlertid ikke optimalt å studere stromal aktivisering under sårheling, fordi den okulær burr ikke trenge til stromal cell lag. Denne metoden er også egnet for klinisk bruk, for eksempel pre-klinisk test av narkotika.

Introduction

Epiteliale lag mange organer er utsatt for skader. Men inneholder de også muligheten til å kompensere for vev tap gjennom sårtilheling. Hornhinnen tilbyr en utmerket modell for å studere sårtilheling. Den danner den eksterne overflaten gir et beskyttende lag for følsom okulær maskiner. Dermed fungerer hornhinnen som en fysisk barriere mot patogener og vanntap. Det består av tre lag. epitel, stroma og endotelet. Epitel i hornhinnen utgjør det ytterste laget av hornhinnen. Epitelceller opprettholde funksjonen barriere av hornhinnen ved holdt seg strengt til hverandre gjennom tett veikryss^1,2,3. En acellular hornhinnen kjelleren membran, Bowmans membran, skiller epitel fra det omfattende stroma, som inneholder ildfaste keratocytes. Under stroma kanal endotelceller næringsstoffer, vann og oksygen til øvre laget.

Hornhinnen avsliting er svært vanlig i klinikken⁴. Skader på hornhinnen er forskjellige, men skyldes hovedsakelig små partikler som støv eller sand, riper eller andre fremmedelementer. Protokollen beskrevet her tar sikte på å gjengi en klinisk relevant type hornhinnen epithelial slitasje. Dermed gir denne protokollen en kontrollerbar og banebrytende metode for klinikere og hornhinnen forskere i egne studier. Vi har utført i vivo skade reparasjon analysen på murine hornhinnen ved slipeenhet vev med en sløv okulær burr, den Algerbrush II. Her vi målrette slitasje bare til sentrale hornhinnen epitel og la de andre delene av orgelet uten skade. Dermed protokollen er ideelt å studere hornhinnen tarmepitelet dynamics eller kjelleren membranen under re epithelialization, celle migrasjon, spredning og differensiering i vivo⁵. Nylig, denne modellen ble brukt til å analysere stamfar celle dynamikk i murine hornhinnen samt å avsløre kapasiteten til differensiert hornhinnen epitelceller med å opprette hornhinnen stamcelleforskningen nisje etter skade^6,7. Etter slitasje, hornhinnen returnerer til normal åpenhet og strekkfasthet. Interessant, viste en studie utført i vitro at re epithelialization skjer uten økt celle spredning⁸. Denne protokollen beskriver tidslinjen uavbrutt healing i murine hornhinnen. Metoden gjelder dermed å teste effekten av legemidler på healing mønstre og hastighet.

Hornhinnen er mye brukt for sårheling studier. Men har mange studier stolt på andre modeller av skade. En veletablert modell av hornhinnen skade er alkalisk brenne som utføres ved å bruke natriumhydroksid (NaOH) med eller uten filter papir på hornhinnen overflaten⁹. Alkaliske eksponering resulterer i en stor og diffus skade som påvirker ikke bare hornhinnen epitel, men også conjunctiva og stroma^9,10. Sterke alkaliske løsninger har vist å indusere hornhinnen sår, opacification og neovascularization⁹. Inflammatoriske celler invadere stroma vanligvis innen 6 h og forblir der til 24 h¹¹. Dermed er alkaliske skade en tilrådelig metode i studier knyttet til stromal aktivisering. En annen type kjemisk skade kan bli påført ved å bruke dimethyl sulfoxide (DMSO) på hornhinnen^9,10. Andre vanlige skader modeller inkluderer incisional sår som trenger gjennom stroma og keratectomy sår, som er begrenset til den øvre delen av stroma^14,15. Disse metodene er også nyttig å svare på spørsmål om stromal sårtilheling. Ulike skader modeller har sine egne fordeler og ulemper. Slitasje eller rensing, av hornhinnen epitel ble først utviklet bruker sløv skalpeller eller blader på ex vivo hornhinner¹⁶. Denne metoden har senere vært brukt i vivo på mus, rotte og kanin^{17,18,19,20,21,22}. Bruker den okulær burr (figur 1), fjerne vi bare en valgt region av epitel, la resten av epitel upåvirket. På denne måten er det mulig å målrette epithelial fjerning til forskjellige deler av hornhinnen. I tillegg kan slitasje størrelsen vurderes med fluorescein flekker. Videre følger her vi slitasje nedleggelse i helbredende perioden.

Denne metoden utgjør flere fordeler i) inkludert svært presis plassering av slitasje området, som ikke er mulig med kjemisk skade, ii) avsliting er raske til å utføre og iii) det er ikke-invasiv. Her beskriver vi metoden med outbred NMRI musen som modell, men dette kan brukes til det store utvalget av musen genetisk modeller og rotte og hare, og dette er vanlige modeller brukes til å studere menneskelig hornhinnen avbrudd.

Protocol

Alle eksperimenter er godkjent av nasjonale dyr eksperiment board. 1. forberedelser Forberede alle løsninger og oppbevares i romtemperatur, med mindre annet er angitt. Følg forskriftene kast brukt og løsninger. Bruk NMRI og ICR outbred aksjer, mellom ages 4-12 uker og begge kjønn. Hvis bruker C57BL/6 belastningen, følger du metoden ketamin-medetomidine forberedelse i trinn 1.3.2. For andre trinn, følger du instruksjonene som er beskrevet i 1.3.3.-1.3.5. Forb…

Representative Results

Dette beskriver en modell for å påføre en slitasje skade musen hornhinnen og antyder hvordan å følge og visualisere helbredelsesprosessen etter slitasje. Nylig ansatt vi denne metoden til å studere rollen til hornhinnen epithelial progenitor celler under sårheling6. Bruk av etablerte verktøy er nøkkelen til en vellykket slitasje eksperiment. Vi, og andre, har brukt Algerbrush II okulær burr (figur 1) for å utføre slitasje<s…

Discussion

Såret er populære verktøy å studere ulike aspekter av hornhinnen homeostase og patologi. Slitasje modellen tilbyr en godt kontrollert metode for å løse aktuelle problemer i Oftalmologi. Visse kritiske punkter i protokollen er imidlertid verdt å vektlegge. Spesielt detaljene beskrevet om veterinærmedisin, sår helbredelse tidslinjen og resultatet er optimalisert for bruk med outbred NMRI og ICR aksjer, men kan variere mellom stammer mus²⁶. Med denne protokollen forblir forsøksdyr bedøvet …

Materials

NMRI mouse	Envigo	275
0.9% NaCl			use sterile
Medetomidine	Vetmedic	Vnr087896	Market name: Cepetor Vet
Ketamine	Intervet	Vnr511485	Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin	Invidior	3015248	Market name: Temgesic
Atipamezol	Orion Pharma	Vnr471953	Market name: Antisedan Vet
Carprofen	Norbrook	Vnr027579	Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment	Dechra	Vnr080899	Market name: Isathal
Fluorescein salt	Sigma-Aldrich	F6377
Phosphate-buffered saline solution			PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)	Algerbrush	6.39768E+11
Cobalt Blue pen light	SP Services	DE/003
Hot plate	Kunz Instruments	2007-0217
Digital SLR camera	Nikon	D80
Adjustable camera arm and clamp	Neewer	10086132	Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp	Prisma
Soft wipe	KimtechScience	7552
CO2 chamber
Dissection toolset	Fine Science Tools
Syringes	Beckton Dickinson	303172
26G needles	Beckton Dickinson	303800
2 mL Eppendorf tube	Sarstedt	689
Tissue casette	Sakura Finetech	4118F
Tissue processing machine ASP200S	Leica
Xylene	VWR	UN1307
Paraffin wax	Millipore	K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm	Sakura Finetech	4123
Microtome	Microm	HM355
Water bath for sectioning	Orthex	60591
Water bath for sectioning	Leica	HI1210
Microtome blade	Feather	S35
Glass slide	Th.Geyer GmbH & Co.	7,695,019
Ultrapure water	Millipore	MPGP04001	MilliQ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA