ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

Summary

ジカ ウイルス (ZIKV) のための Ifnar1^-/-マウスのモデルの immunoprivileged 器官の抗原特異的 T 細胞応答を評価するためのプロトコルを説明します。このメソッドは、有効性評価の貴重なも ZIKV ワクチンの免疫病態と保護細胞メカニズムを調査するために極めて重要です。

Abstract

ジカ (ZIKV) は、ギランバレー症候群につながると精巣の損傷 (例えば脳、精巣)、immunoprivileged の臓器に炎症を引き起こすことができます。ZIKV と感染、免疫細胞は組織に潜入する示されています。ただし、ZIKV 感染中保護および/またはこれらの免疫細胞の免疫病態の定義細胞メカニズムが、ほとんど知られていません。ここで、ZIKV に感染したマウスのこれらの immunoprivileged 器官のウイルス固有の T 細胞機能を評価する手法について述べる.これらのメソッドが含まれて、) ZIKV 感染とワクチン接種 Ifnar1^-/-マウス;脳、精巣、脾臓のウイルス感染症や炎症を検出する免疫アッセイ、蛍光抗体法、b) 病理組織学c) ZIKV 由来 T 細胞エピトープ; の四量体の準備d) 脳、精巣、脾臓から分離された単球 ZIKV 特異的 T 細胞の検出。これらのアプローチを使用して、immunoprivileged の臓器に浸透して抗原特異的 T 細胞を検出し、感染中にこれらの T 細胞の機能を評価することが可能です: ウイルス クリアランスを介して潜在的な免疫の保護と炎症を悪化する/または免疫病態。これらの調査結果は、ZIKV の予防接種によって誘導される T 細胞の寄与を明らかにすることができます。

Introduction

ZIKV は、最初は 1947 年にウガンダで熱性のアカゲザルからに分離された蚊媒介性フラビ ウイルスです。近年、ZIKV アメリカと小頭症とギランバレー症候群^1,2,3に予期しないリンクの急速な普及のための公衆衛生緊急事態となっています。疫学的データからは、4,000 あたり約 1 ギランバレー症候群の原因となる感染大人⁴ZIKV を疑われています。さらに、ZIKV と精巣感染/損傷マウス モデルにおける相関が実証されている、ZIKV 感染症、特定の状況下が血液精巣関門をバイパスでき、最終的に男性不妊^{5 につながることを示唆}.これらの調査結果は、ZIKV 伝染の間に保護または病理学的免疫応答の誘導を完全に理解することの重要性を強調表示します。

多くの遺跡、ZIKV に細胞免疫反応について学ぶべきこと。CD4⁺および CD8⁺ T 細胞カプシド、封筒、および非構造蛋白 1 (NS1) レスポンスが ZIKV に感染したサルと人間^6,7,8で観察されています。マウスのいくつかの研究が示されているその CD8⁺ T 細胞 ZIKV レプリケーション^9,10,11を制御する保護の役割を果たします。重要なは、Juradoらは ZIKV 感染が血液脳関門の破壊と血管周囲浸潤 cd8 陽性の結果を実証⁺ Ifnar1^-/-マウスの精巣内エフェクター T 細胞。さらに、彼らはことを示した CD8⁺ T 細胞 ZIKV 関連麻痺を扇動し、新生児脳免疫病理学の役割を果たすようです。以前の研究では、ZIKV-E_{294 302}テトラマーを調製し、, その ZIKV 固有 CD8⁺ T 細胞が脳や脊髄、設計のための重要な含意があるかもしれない Ifnar1 の ZIKV 感染^-/-マウスの存在ZIKV ワクチン¹⁰のそして開発。

ZIKV 感染を防ぐため予防接種の緊急の必要性に対応して、複数のワクチン開発、RNA ワクチン、遺伝子組換えのベクトルに基づくワクチン精製タンパク質サブユニット ワクチンなどの前臨床段階にあります。プラスミド DNA ワクチンは、フェーズ 1 臨床試験¹²です。ZIKV ワクチンの有効性と安全性の評価は、したがって、ことが重要です。ワクチンの利点の 1 つ、ZIKV から保護するために重要となる T 細胞の特定の応答を引き出すためにできることです。免疫マウスの検出でしたアデノ ウイルス ベクター ベースの ZIKV ワクチンにより誘導される T 細胞免疫 ZIKV 由来 T 細胞エピトープ関連テトラマーを使用することにより、M と E の両方の糖タンパク質は、堅牢な抗原特異的 CD8 を誘導するために示されていた⁺T 細胞免疫¹³。

ウイルス感染 T 細胞受容体 (TCR) に主要組織適合遺伝子複雑な (MHC) 分子によって提示されたペプチド抗原の認識、ホスト¹⁴を保護するため重要な T 細胞を介したメカニズムです。この理論に基づき、テトラマー技術は、抗原特異的 T 細胞が免疫¹⁵の調節に果たす役割を解明するためのユニークなツールです。このプロトコルは、テトラマー技術を用いた ZIKV 感染症の Ifnar1^-/-マウスのモデルの確立と脾臓、脳、およびマウスの精巣における反応性 T 細胞の検出を説明します。また、検出および免疫マウスにおける ZIKV ワクチン (AdC7-M/E) によって誘導される T 細胞免疫反応性を評価する ZIKV E_{294 302}テトラマーを使用しました。本研究では、immunoprivileged 器官の T 細胞の応答を調査するためのガイダンスを提供し、胎盤や胎児の脳の潜在的なアプリケーションのための参照を提供します。

Protocol

動物実験は、ウイルス性の疾病の予防、中国 CDC 動物介護制度と国立研究所の使用委員会によって承認されました。次の機関動物愛護と動物のプロトコルの利用委員会が承認したすべての実験を行った。 1. ウイルス感染症 続ける大人 (8 週齢に 6) Ifnar1-/- (男性 50%、女性 50%) マウス標準的な特別な病原体フリー (SPF) の条件で、食料や水に定期的にアクセスを許可して。 ZIKV経由で1 × 104フォーカス形成単位 (FFUs) ウイルスを含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) バッファーに ZIKV の 100 μ L のレトロな軌道接種と Ifnar1-/-マウスに感染します。同様に、PBS の等量を制御マウスを提供します。注意: ABSL2 の条件の下でマウスを感染し、バイオ セーフティ キャビネットにおけるウイルス感染マウスにこれらの手順を実行します。 15 日間の重量とマウスの臨床症状 (震え、千鳥 3 月、二国間弛緩な後肢) を毎日監視します。 2. ZIKV ワクチン接種 6 と 8 週齢の間 Ifnar1-/- (男性 50%、女性 50%) マウスを使用します。18-29 ° C とアクセスの 12 h 明暗サイクルの標準の SPF 状態でマウスを飼うため、食料と水。 Ifnar1-/-マウス ZIKV ワクチンを予防接種: AdC7-M/E の 100 μ L を注入 [4 x 1010 (ウイルス粒子)] PBS でバッファー経由で23 G 針を用いて 1 mL 注射器を使用して筋肉内注射 (イオ ミン ルート)。 同様に、PBS の等量とマウス コントロールを挿入します。 3. 脾臓からの単球分離 注: 前述の16脾臓から単球の分離、説明します。 (1 L/分の流量) と 5% イソフルラン インパクター 100% 酸素を使用して免疫と ZIKV に感染したマウス 7 d 後接種を麻酔します。頚部転位によってマウスを安楽死させます。その後、75% エタノールに浸し全体のマウスがすぐに。注意: この手順以降からすべて実験プロシージャの実行すべき無菌バイオ セーフティ キャビネットです。 針を使用して、発泡スチロールの皿に (安楽死、以前感染/免疫) マウスの手足を上向き腹部で固定します。 生殖不能のメスの胸部に腹部の正中線に沿って皮膚をカット、腹部の筋肉をハサミで切って、腹腔内を公開、肝臓を慎重に取り外します。注: 胃の左側に長い、暗赤色の臓器は脾臓です。 脾臓を削除、それを洗い流し、血液を削除し、冷えたロズウェル パーク記念研究所メディア (RPMI) 1.5 mL に PBS で 3 倍。氷の上脾臓を維持します。 脾臓から単一細胞懸濁液を生成するために 50 mL のチューブの上に滅菌 40 μ m メッシュ セル ストレーナー、統轄を配置し、冷たい RPMI 培地含む 10% 牛胎児血清 (FBS) 2 mL を追加します。5 mL シリンジのプランジャーを使用して、機械的に、統轄をマッシュ アップし、器官が完全にメッシュを地面にされるまでメディアを追加します。 15 mL チューブに細胞懸濁液を転送し、4 ° C で 5 分間 600 × gで遠心分離上澄みを除去します。 (NH4Cl、ナ2EDTA、および KHCO3;材料の表を参照してください)、赤血球 (RBC) 換散バッファーの 5 mL の細胞を再懸濁します、5-6 分間室温で溶解反応を孵化させなさい。 10 ml の冷たい RPMI/FBS 中の赤血球溶解を停止し、4 ° C で 5 分間 600 x gでチューブを遠心分離上澄みを除去します。 10 mL (10% 巻/巻 FBS RPMI と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン) の完全 RPMI 培地で細胞を再懸濁します。小さなチューブに細胞懸濁液の 10 μ L を転送、0.4 %wt/巻トリパン ブルーの 10 μ L を混ぜて、診断を使用してセルの数をカウントします。 4. 脳や精巣からの単球分離 雄マウスの ZIKV 感染 7 d の後接種、(1 L/分の流量) と 5% isofluranein 100% 酸素を使用してを麻酔します。頚部転位によってマウスを安楽死させます。その後、75% エタノールに浸し全体のマウスがすぐに。注意: このステップからすべて実験手順必要がありますで実行する無菌バイオ セーフティ キャビネットです。脳や精巣からの単球分離は、前述の17に説明します。 まな板の上の腹臥位で (安楽死、以前の感染) の雄マウスを固定します。 ストレート 1 × 2 歯鉗子で頭皮を保護し、頭蓋骨を公開するために頭皮を正中切開アイリスはさみを使用します。 鋭いピンセットで軌道の 2 つの側面をクランプし、脳を修正します。後頭にアイリスはさみの先端を置き、頭蓋骨に横方向にカットします。反対側にこの手順を繰り返します。 使用は鋭いアイリスはさみ鼻に向かって、正中線を同じ空洞から慎重にカットします。はさみの最後の脳の傷害を回避することが可能として表面を維持してください。 鉗子で脳を持ち上げ、脳神経繊維を慎重に分析するアイリスの鋭いはさみを使用します。鉗子で脳を取り出し、冷たい RPMI/10% FBS 培地 5 mL を含む 15 mL チューブにそれを置きます。 腹部の皮膚をピンセットでつかむし、アイリスはさみを使用して外皮と腹部の壁を通して縦切開を行うし、腹部の最下部の一部を公開します。切開まで精巣をプッシュします。軽くピンセットで脂肪層を引き、両側に球状の精巣を公開します。 使用鋭いアイリスはさみ脂肪層および精巣上体を慎重に分析します。鉗子で冷たい RPMI/10% FBS 培地 5 mL を含む 15 mL チューブに精巣を配置します。 単一細胞懸濁液を生成すると、脳や精巣から、50 mL のチューブの上に 100 μ m メッシュと無菌細胞ストレーナーに器官を配置し、冷たい RPMI/10% FBS 媒体の 2 mL を追加します。5 mL シリンジのプランジャーを使用すると、マッシュの器官と器官が完全にメッシュを地面にされるまでメディアを追加します。 15 mL チューブに細胞懸濁液を転送し、4 ° C で 5 分間 600 × gで遠心分離上澄みを除去します。 30% 密度勾配媒体の 5 mL の細胞を再懸濁します、非常にゆっくりと 70% 密度勾配中 15 mL チューブ 2 mL に追加します。 ブレーキ電源、中間層からリンパ球 800 x gで 30 分間取得で 4 ° C でチューブを遠心分離します。 中間期を新しい 15 mL チューブに転送、冷たい RPMI/10% FBS 媒体の 10 mL を追加し、4 ° C で 10 分間 300 x gでチューブを遠心上澄みを除去します。 10 ml の冷たい RPMI/FBS の中の細胞を再懸濁します、4 ° C で 5 分間 600 x gで遠心分離機のこと上澄みを除去します。 完全 RPMI 培地 10 mL で細胞を再懸濁し、ステップ 3.9 のようにセルの数をカウントします。 5. 四量体の準備 NdeI と XohI 制限サイト18pET28a ベクトルを用いた α 3 ドメインと β2m の C 末端にビオチン化サイト タグで H 2 Dbの細胞外ドメインを表現するプラスミドを構築します。 表現し、H 2 Db及び β2m20を前述のようの封入体を準備します。 Renature MHC/ペプチド複合 H 2Db-e294 302を浄化して。 [100 mM トリス-HCl (pH 8.0) 400 mM L-アルギニン、2 ミリメートルの EDTA Na、GSG、5 mM と 0.5 mM GSSG] リフォールディング溶液 200 mL を準備します。プロテアーゼ阻害剤を追加: 2 mL、フッ化物 phenylmethylsulphonyl (PMSF、株式 100 ミリメートル) ペプスタチン (在庫 2 mg/mL) を 100 μ l 添加 leupeptin (在庫 2 mg/mL) を 100 μ l 添加します。30 分間、4 ° C でバッファーをクールします。 H 2 Dbβ2m とペプチドをリフォールディングのソリューションに追加します。 500 μ L のシリンジを使用してグアニジン ソリューション (株式を 30 mg/mL) に溶解した β2m を挿入します。このため、5 mL 注射器 23 G 針を使用し、一滴ずつのリフォールディングのソリューションに β2m を注入します。常に、ゆっくりと 4 ° C で 150 rpm で攪拌ソリューションを保持します。 リフォールディング溶液中 β2m が解散した後、E294 302ペプチド DMSO を 200 μ l 添加の 2 mg を解決し、ピペットを使用してリフォールディングのソリューションにそれを注入します。ゆっくりと 4 ° C 15 分で 150 rpm でソリューションをかき混ぜます。 グアニジン溶液中に溶けて H 2 Dbの 1.5 mL を注入します。4 ° C、8 – 10 h で H 2 Dbの巻き戻し 150 rpm で攪拌バー回転を維持します。注: ソリューションは、冷蔵室でクローズド ボックスに置かれました。 10 kDa の膜を用いた加圧チャンバーにリフォールディングモモルチャリンの蛋白質を集中します。商工会議所に [20 mM トリス-HCl (pH8.0) 50 mM NaCl] バッファーを交換し、30-50 mL の最終巻に集中します。 リフォールディング ソリューションを遠心管に転送し、4 ° C で 15 分間 2,500 x gでスピン 慎重に上清を 10 kDa 遠心フィルターに転送し、さらに 30 分間 2,500 x gで 500 μ L の最終巻に集中。 新鮮なチューブに上清を転送、12,000 × gで 15 分間浄化で S200 をもつタンパク質それをスピン 10/300 GL ゲルろ過クロマトグラフィー。 MHC の複合ピークを収集し、350 μ L の最終巻に集中します。 ビオチン化用 500 μ L 反応のボリュームを生成する次の順序で評議員を追加: 溶液を 100 μ l 添加 [0.5M ビシン (pH 8.3)]、100 μ L のソリューション B (100 mM ATP、100 mM MgOAc、200 µΜ ビオチン)、余分な d-ビオチン (500 µΜ ビオチン) を 100 μ l 添加、Leupeptin (2 mg/mL) の 0.5 μ L、0.5 μ L ペプスタチン (2 mg/mL) の 20 μ L の酵素・ ビラ (60 μ g)。4 ° C で一晩反応管を孵化させなさい注意: 任意の EDTA を biotinylating 反応に追加しないでください。 浄化、S200 を使用して MHC 10/300 GL ゲルろ過クロマトグラフィ任意の余分なビオチンを削除します。 ストレプトアビジン シフト試金18biotinylating 効率を決定します。 A、B、および C、30 分間氷の上の 3 つのサンプルを準備します。10% で結果を分析し、SDS ページ。サンプル A は、ビオチン化 MHC の分子の 8 μ L と交換バッファー、ビオチン化 MHC の分子の 8 μ L のサンプル B と 8 μ L 交換バッファーとストレプトアビジン (20 mg/mL) の 2 μ L のサンプル C ストレプトアビジン (20 mg/mL)、2 μ L の 2 μ L で構成されます。注意: サンプルを沸騰していません。 多量のビオチン標識 MHC 分子を形成します。 モル比が 1:5 すべてのビオチン化の MHC の分子の完全な結合を確保するためにフィコエ リスリン標識ストレプトアビジンとビオチン化 E294 302ペプチド H2Db複雑なを混合して四量体を生成します。 ストレプトアビジン-共役 tetramerization のために必要な量を計算します。 MHC/ペプチド複合体タンパク濃度とモルの重量を占めるのモグラを決定する (例: 総蛋白の 1.8 mg 40 nmol を =)。 MHC/ペプチドのモグラを 5 で割って必要なストレプトアビジン共役のモルの計算 (例: 40/5 = 8 nmol ストレプトアビジン複合体)。 ストレプトアビジン (μ g) で必要とされる金額を計算ストレプトアビジン共役によって (例: ストレプトアビジン PE [300,000 g/M] → 8 必要 nmol = 2,400 g)。 10 個のサンプルにストレプトアビジン フィコエ リスリンを分割します。管内のビオチン化 E294 302ペプチド H2Db複雑な 20 分間隔で各サンプルに追加します。最後のサンプルをロードした後は、暗闇の中で一晩 4 ° C で反応管を孵化させなさい。 100 kDa スピン チューブに multimerized 試薬を適用し、のボリュームに 4 ° C で 2,000 × gで遠心分離で濃縮 < 100 μ L。 4 mL の PBS (pH 8.0) を使用してスピン チューブのサンプルを希釈し、もう一度集中 < 100 μ L。 バッファー交換ステップ PBS (pH 8.0) で繰り返し 4 x。 500 に再度容量を埋める μ L の PBS (pH 8.0) を使用します。4 ° C で 2,000 x gで推定濃度 2 〜 2.5 mg/mL のサンプルを集中します。4 ° C で暗闇の中でサンプルを格納します。 6. フローサイトメトリー 任意の非特異的結合を防ぐために 20 μ L (希釈率 1: 200)、10 分間あたりの抗マウス CD16/CD32 Fc 受容体ブロック試薬の 0.1 μ L で 4 ° c (3.9 のステップやステップ 4.15) から細胞懸濁液を孵化させなさい。 4 ° C で少なくとも 15 分 20,000 × gで 4 量体チューブを遠心分離します。 96 ウェル platecontaining 1 x 10 の6セルにも各細胞懸濁液の 20 μ L を追加します。 すべての実験のチューブを染色する E294 302テトラマー ミックスの十分な量を準備します。アカウントにこのミックスの総量の 15% の過剰をピペッティング エラーに備えます。FACS バッファーで E の294 302テトラマー (2 mg/mL、1 μ L/テスト) を希釈 (PBS、0.5 s) E294 302テトラマー ミックスの 20 μ L を各テストに追加します。 96 ウェル プレートに E294 302テトラマー ミックスの 20 μ L を追加します。この手順の最後に、各ウェルの最終的なボリューム 40 µL.Incubate 30 分間室温で暗闇の中板はずです。 細胞懸濁液に 1 μ L/テストで一次抗体 (FITC 結合または APC 共役の抗 CD3 (0.2 mg/mL)、PerCP 標識抗 CD8 (0.2 mg/mL)) を追加し、その後、暗闇の中で 30 分間、4 ° C で孵化させなさい。 2 セルを洗浄して FACS バッファーおよび 600 x gで 5 分間でそれらは慎重に、上清を吸引し、FACS バッファーの 200 μ L で細胞を再懸濁しますは遠心分離機の 2 ml x。 暗闇の中、フローサイトメトリーによる解析まで 4 ° C で一時的にサンプルを格納します。 フローサイトメトリーによる解析の次のゲートの戦略を使用します。 サイド散布 (SSC) 周辺と前方散乱 (FSC) をプロットすることによって斜めにクラスター化されたシングレットにゲートを作成します。 その後、CD3 にゲート側散布 (SSC)対CD3; による細胞の+次に、CD3 にゲート+ CD8+のセル;最終的には、アウトライン CD8+テトラマー+細胞19。 7. 病理組織学、蛍光抗体法、免疫アッセイ 病理組織学的アッセイ ZIKV 感染 Ifnar1-/-マウス 7 d 後接種の脳および精巣の組織を収集し、4% 中性緩衝ホルムアルデヒドでそれらを修正します。注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します。 組織をパラフィンに埋め込みます。 5 mm、vibratome を使用して組織をセクションします。 ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 組織を染色します。 免疫組織化学的アッセイ Deparaffinize、水分補給、および抗原検索ティッシュ セクション、手順に基づいて説明した21。 PBS (pH 7.6) で 10 分間 3% H2O2で切片を扱い、10 分間の 1% ウシ血清アルブミン (BSA) でそれらをブロックします。 ラット抗マウス CD3 抗体を用いた組織切片を孵化させなさい (希釈: 1/1,000) 室温で 8 時間、その後、一晩で, 4 ° C で。 PBS で組織を洗浄、その後、ビオチン標識二次抗体の 3 滴とそれらを孵化させなさい (希釈: 1/1,000) アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼの 3 滴に続いて、室温で 2 時間 (希釈: 1/200) 30 分間室温で。 バインド、3 滴、30、30-ジアミノベンジジン tetrahydrochloride (希釈: 1/1,000)、22を前述のよう。 マイヤーのヘマトキシリンで切片を counterstain します。 蛍光抗体法 室温で 10 分間凍結精巣セクション (6 mm) を空気乾燥します。 10 分間氷冷アセトンで修正してください。 3 x の PBS でセクションを洗浄し、ブロック バッファーとそれらをブロック (0.3% 1 %bsa トリトン、1x PBS) 37 ° C、30 分で。 一次抗体 (Z6) と組織切片を孵化させなさい (20 μ g/mL) 4 ° C で一晩します。 PBS で組織を洗浄し、二次抗体を適用 (希釈倍率: 1/200) 37 ° C で 1 時間 PBS の切片を洗って 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) を用いた核のそれらを counterstain (希釈倍率: 1/1,000)、製造元の指示に従います。

Representative Results

これらのメソッドは、次の ZIKV 感染症モデルマウスを開発しました。生後 6-8 週 Ifnar1-/-マウスは、retroorbital 注射によって、ZIKV の 1 x 104フォーカス形成ユニット (FFU) と感染しました。病的症状兆候 (図 1A) と重量変化 (図 1B) は、ZIKV に感染した後 Ifnar1-/-マウスで観察されました。マウスの脳は、明白な浮腫、充血 (図 1C) を示した。一方、精巣が徐々 に縮小した (図 1D)。さらに、病理学的変化と組織の破壊は、脳および精巣 (図 2A) で発見されました。脳および精巣 (図 2B) で、ZIKV を検出する蛍光抗体法を行った。ウイルス負荷の高い脳や精巣 (図 2B) 免疫染色によって検出されました。免疫組織化学は、CD3 の堅牢な浸潤を示した ZIKV (図 2C) 感染マウス脳に+ T 細胞します。 検出し ZIKV 特異的 T 細胞応答を評価するには、我々 はマウスの MHC を準備-私は H-2Db-e294 302四量体。ペプチド E294 302正しく H 2Db renature を助け、可溶性の MHC の高い金額をもたらす-私は (図 3A)。シフト試金でビオチン化で高効率の (図 3B) が観察できます。その後、3 つストレプトアビジン蛍光 (APC、PE と BV421) – pMHC のタグ – 私テトラマー ZIKV 特異的 T 細胞 (図 3C) を検出する作り出されました。PE 標識テトラマーいた特定の CD8 を検出する高い治療効果+差は統計的に有意ではなかったが、APC と BV421 ラベル テトラマーと比較して T 細胞。 我々 は ZIKV (3.49 ± 0.45%) の 7 d 後接種でフローサイトメトリーによる感染マウスの脾臓内 ZIKV 特異的 T リンパ球を検出 E294 302テトラマーを使用して。また、AdC7-M/E ワクチンの予防接種 4 週間後に、このプロトコルのセクション 3 で説明した方法と同様に、ZIKV 特異的 T リンパ球に検出された脾臓 (6.89 ± 1.36%)(図 4)。 さらに、我々 は ZIKV 感染後脳や精巣などの immunoprivileged 器官に浸潤リンパ球を検出しました。ゲートは CD3 の選択に設定された+CD8+ T 細胞の脳および精巣のリンパ球の合計。脳内 E294 302四量体特定の T 細胞の割合が高いを検出できる (CD3 で 42.2%+CD8+ T 細胞) と、精巣 (CD3 26.4%+CD8+ T 細胞) リンパ球 (図 5)。 図 1: Ifnar1-/-マウスの ZIKV 感染症の特性。生後 6-8 週 Ifnar1-/-マウスは、ZIKV の retroorbital 注入による 104フォーカス形成単位 (FFU) に感染したし、PBS 投与マウスは感染していないコントロールとして使用されました。形態 (A) と (B) 感染の Ifnar1-/-マウスの体重の変化を監視しました。赤の矢印は、Ifnar1-/-マウスに感染後 myeloparalysis モーター対麻痺と提出を示しています。7 d 後接種に (C) 脳と 0、7、14、30 日後の接種で (D) 精巣が収穫されました。マウスの精巣および脳の代表的なイメージの定規でサイズを示すとおりです。誤差範囲を表す平均 ± SEM. n = 10 マウス実験ごとグループごと。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: ZIKV と脳と ZIKV に感染した Ifnar1-/-マウスの精巣におけるリンパ球を検出します。(A) このパネルは 7 d 後接種の否定的なコントロールと比較して ZIKV に感染したマウスの精巣および脳の病理組織変化をショー。スケール バー = 25 μ m (左側のパネル) と 50 μ m (右側のパネル)。反 ZIKV Z6 抗体 (緑) と (B)、蛍光アッセイを行った。全ての組織サンプルは、7 d の後接種で ZIKV に感染したマウスから収集されました。核染色 DAPI で (青)。スケールバー = 50 μ m。 (C) 免疫組織化学ショー CD3 の堅牢な浸潤+ T 細胞の脳や精巣に。スケール バー = 25 μ m (左側のパネル) と 50 μ m (右側のパネル)。紫は、ヘマトキシリンを示します、ブラウンは、CD3 抗体を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: ZIKV 固有の pMHC の準備-私テトラマー 。(A) H 2 Db E294 302のバインディングは、リフォールディング体外が明らかにしました。青 H-2Db-e294 302タンパク質を示します。オレンジは、ペプチドせず負のコントロールを表します。(B) このパネルは、H 2 Db-e294 302シフト試金を示しています。(C) モックは、PBS コントロールを表します。3 つのストレプトアビジン蛍光 (APC、PE と BV421) – pMHC のタグ – 私テトラマーが ZIKV 特異的 T 細胞を検出するために使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4:ウイルス特異 CD8 のフローサイトメトリー法による解析+ZIKV 感染し、ワクチン接種マウスの脾臓における T 細胞。6-8 週齢で Ifnar1-/-マウスは ZIKV のいずれか 104フォーカス形成単位 (FFU) に感染していたまたは AdC7-M/E またはネガティブ コントロールとして PBS の 4 x 1010ウイルス粒子の単回投与を受信します。感染 7 日後、4 週後の接種後マウス脾細胞収穫し、フローサイトメトリーで分析しました。一方向の分散分析を用いて平均 ± SD. 統計的分析を行ったデータが表示されます (重要ではない: P > 0.05; *P < 0.05; * *P < 0.01; * * *P < 0.001; * * *P < 0.0001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。  図 5:脳と ZIKV に感染したマウスの精巣に+ T 細胞のウイルス特異 CD8 の戦略と代表の結果をゲーティングします。脳および精巣 (B)、(A) における浸潤リンパ球の代表的なプロットが表示されます。リンパ散布+と CD3 を選択するゲートの連続をセット+イベント。これらは、CD8 の+エピトープ特異的 T 細胞の解析のためのイベント、ゲートします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Discussion

免疫原性の T 細胞エピトープは、病原体²³に対して細胞性免疫に重要な役割を果たしています。したがって、immunoprivileged 臓器 ZIKV 特異的 T 細胞の検出は自然の ZIKV 感染に対する T 細胞の反応を理解する重要な手法です。一方、T 細胞応答の検出はウイルスのワクチンの有効性を調査するための優れたツールです。ここで、脾臓、脳、および主要抗原エピトープ E_{294 302}テトラマーの準備 ZIKV 感染マウスの精巣からリンパ球の分離を含む実験を視覚化するための包括的なプロトコルを示すと、ZIKV 固有 CD8 の認識⁺ T 細胞の ZIKV 感染マウスの immunoprivileged 器官。

以前の研究では、ライブ ZIKV またはその RNA を ZIKV が血液精巣関門をバイパスでき、生殖システム²⁴の増殖を示す男性患者の精液で検出できることを示した。以前は、我々 はまた、ZIKV できます精巣損傷を引き起こすし、マウス²⁵で男性不妊につながることを示した。ZIKV 感染アカゲザル、ウイルス血症につながることができ、内臓器官だけでなく、中枢神経系 (CNS) におけるウイルス RNA が検出できます。免疫組織化学では、ZIKV 特異的抗原が中枢神経系と複数の末梢臓器²⁶で提示されたことを明らかにしました。また、マウスモデル、ZIKV 感染症は堅牢な抗 CD8 を誘導することができます⁺脾臓、中枢神経系²⁶T 細胞応答。

前作と比較して、本研究 ZIKV 固有 CD8 を検出する体系的な方法を確立する⁺ T 細胞反応脳と精巣は、immunoprivileged サイトします。ZIKV 感染マウスの immunoprivileged 器官でウイルス特定の T 細胞の機能を評価することが重要です。ZIKV 固有 CD8 を検出するテトラマーの使用⁺ T 細胞 immunoprivileged の臓器に応答は非常に ZIKV 感染とその宿主免疫応答の私達の理解を高めます。E_{294 302}四量体を使用すると、脳や精巣のウイルス特異 T 細胞を分離できること、フローサイトメトリーによる ZIKV 感染の間の保護と免疫病態細胞メカニズム解明のため。一方、それはさらに、CD8 の機能を調査する研究者のために有用⁺ T 細胞、ZIKV を制御するまたは ZIKV の伝染の間にこれらの器官の免疫を強化します。

マウス抗原特異的 CD8 を分析する⁺ T 細胞応答 immunoprivileged 器官で、我々 は H 2 D^b-e_{294 302}テトラマーを準備し、CD8 を検出⁺ T 細胞のフローサイトメトリーによる。テトラマーは、抗原特異的 T 細胞を検出するための強力なツールです。ここでは、3 種類の蛍光色素標識されたストレプトアビジン (APC、PE と BV421) が生成されました。APC、BV421、および PE 標識テトラマー PE 標識 pMHC 抗原特異的 T 細胞を検出するための統計的に有意な違いはありませんが-私テトラマー最良の結果が得られました。したがって、PE 標識の四量体は、この研究を通して使用されました。興味深いことに、PE 標識 H 2D^b-e_{294 302}テトラマーに基づいて、我々 は脳や精巣に血液からウイルス特定の T 細胞の移行の能力を示すの抗原特異的 T 細胞の高い比率を検出immunoprivileged 器官。

ただし、プロトコルにいくつかの制限があります。四量体検出、MHC 拘束に依存ため H 2D^b-e_{294 302}テトラマーは人間の T 細胞の検出に便利です。主要抗原 HLA 制限ペプチドのスクリーニングはまだ必要です。その上、レトロ軌道感染 ZIKV 感染症に有効であるが一部の研究者のための便利な操作をできないことがあります。したがって、腹膜、皮下、または静脈内投与を含む感染症の他のルートがおすすめ。

ここで説明したプロトコルでは、重要なステップは、脳や精巣からの単球分離です。質の高いリンパ球; を取得することが重要です。したがって、たとえば、遠心速度、研削の組織の強度と脳および精巣組織の郭清に注意を払うことが重要です。その上、四量体の準備のためプロテアーゼ阻害剤 (PMSF、ペプスタチン leupeptin)、便利劣化されてからタンパク質を保護することです。したがって、プロテアーゼ阻害剤をリフォールディング バッファーに追加し、四量体準備のプロセス中に、バッファーを交換する理にかなって。

結論としては、ZIKV 感染症の Ifnar1^-/-マウスのモデルの immunoprivileged 器官における抗原特異的 T 細胞反応を検出する方法を提案する.このプラットフォームは、新興・再興ウイルスは血液や immunoprivileged の器官間の障壁をバイパスすることができます免疫メカニズムの調査に広く適用できます。また、本研究は候補ワクチンと免疫療法の今後の発展の道を開くかもしれない。

Materials

Z6	our lab		Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3	Santa Cruz	sc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L)	ZSGB-BIO	ZF-0308
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated	CWBIO	CW0115
FITC anti-mouse CD3	Biolegend	17A2
APC anti-mouse CD3	Biolegend	100236
PerCP anti-mouse CD8a	Biolegend	100732
Percoll	GE Healthcare	P8370
PMSF	Ameresco	0754-5G	Toxic and corrosive reagent. Handle with care
Streptadivin	BD	S4762-FZ	Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and  stored at -20 °C
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG	5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20ºC
Leupeptin	Sigma	L8511	5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at – 20ºC
Peptides	Scilight-peptide		Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C
RPMI 1640	Hyclone	SH30809.01	Must be stored at 4°C
DMSO	MP	219605590	Store at room temperature.
APC-Streptadivin	BD	554067	Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze.
FITC-Streptadivin	BD	554060	Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze.
PE-Streptadivin	BD	554061	Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze.
BV421-Streptadivin	BD	563259	Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze.
PageRuler Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Must be stored at 4°C
Cell Strainers	BF	BF10-5040	Store at room temperature.
Amicon Ultra 100kDa	Millipore	UFC510024	Store at room temperature.
Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific
FACS Cantol			Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE healthcare	28990944
AKTA PURE	GE healthcare
red blood cell lysis buffer	Solarbio	R1010	Store at 4°C.