Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

Summary

Ifnar1^{– / –} fare modeli immunoprivileged organlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon için antijen spesifik T-hücre yanıtları değerlendirmek için bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem koruma hücresel mekanizmaları ve immunopathogenesis ZIKV aşı soruşturma için çok önemli ve aynı zamanda onların etkinliğini değerlendirme için değerlidir.

Abstract

Zika virüs (ZIKV) iltihap immunoprivileged organlarda (Örneğin, beyin ve testis), Guillain-Barré sendromu için önde gelen ve testis zarar neden olabilir. ZIKV ile bir enfeksiyon sırasında bağışıklık hücreleri doku sızmak için gösterilmiştir. Ancak, koruma ve/veya immunopathogenesis bu bağışıklık hücrelerinin ZIKV enfeksiyon sırasında tanımlamak hücresel mekanizmaları hala büyük ölçüde bilinmeyen vardır. Burada, bu immunoprivileged organların farelerin ZIKV bulaştırmak virüs özgü T-hücre işlevindeki değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yöntemler içerir bir) bir ZIKV enfeksiyon ve aşı aşı Ifnar1 farelerde;^{– / –} b) histopatoloji, ayirt ve bulmak belgili tanımlık virüs enfeksiyonu ve inflamasyon beyin, testis ve dalak için immünhistokimya deneyleri; c) ZIKV elde edilen T-hücre epitopları tetramer hazırlanması; d) ZIKV özgü T hücreleri beyin, testis ve dalak izole monosit tespiti. Bu yaklaşımları kullanarak, immunoprivileged organları sızmış antijen spesifik T hücreleri tespit etmek ve bu T hücrelerinin işlevler enfeksiyon sırasında değerlendirmek için mümkündür: potansiyel bağışıklık koruma yolu ile virüs temizleme ve iltihap azdırmak için/veya immunopathogenesis. Bu bulgular da katkı ZIKV karşı aşı indüklenen T hücrelerinin netleştirmek için yardımcı olabilir.

Introduction

ZIKV ilk 1947 yılında Uganda bir febril rhesus makak izole bir sivrisinek kaynaklı flavivirus var. Son zamanlarda, ZIKV bir halk sağlığı acil, Amerika’nın ve onun beklenmedik bağlantı microcephaly ve Guillain-Barré sendromu^1,2,3, hızlı yayılması nedeniyle olmuştur. Epidemiyolojik veri, ZIKV yaklaşık 1 4.000 başına Guillain-Barré sendromu nedeni olarak yetişkin⁴enfekte şüphelenmiştir. Ayrıca, ZIKV ve testislerde enfeksiyon/hasar fare modeli arasında bir ilişki, belirli koşullar altında ZIKV enfeksiyon kan-testis bariyeri atlamak ve sonunda erkek kısırlığı^{5 kurşun düşündüren gösterilmiştir} . Bu bulgular koruyucu veya patolojik bağışıklık yanıtı indüksiyon ZIKV enfeksiyon sırasında büyük bir anlayışla önemini vurgulayın.

Çok ZIKV hücresel bağışıklık yanıtlarını hakkında öğrenilmesi gereken kalır. CD4⁺ ve CD8⁺ T hücre kapsid, zarf ve mekansal protein 1 (NS1) yanıt ZIKV enfekte maymunlar ve insanlar^6,7,8‘ de görülmektedir. Farelerde, çeşitli çalışmalar göstermiştir bu CD8⁺ T hücre ZIKV çoğaltma^9,10,11kontrolünde koruyucu bir rol oynamaktadır. Önemlisi, Jurado vd. ZIKV enfeksiyon kan – beyin bariyerini dağılımı ve CD8 perivasküler infiltrasyon sonuçları gösterdi⁺ Ifnar1^{– / –} fareler testis içinde efektör T hücreleri. Ayrıca, onlar gösterdi ki CD8⁺ T hücre ZIKV ilişkili paralizi uyanmaya ve neonatal beyin immunopathology bir rol oynamaya görünür. Bir önceki çalışmada, ZIKV-E_294-302 tetramer hazırlanan ve gösterdi o ZIKV özgü CD8⁺ T hücreleri mevcut beyin ve omurilik kordonlar farelerin tasarımı için önemli sonuçları olabilir ZIKV enfekte Ifnar1^{– / –} , ve ZIKV aşılar¹⁰gelişimi.

Aşı ZIKV enfeksiyonu önlemek için acil bir ihtiyaç yanıt olarak, çeşitli aşılar geliştirme, RNA aşıları, vektör tabanlı rekombinant aşı ve saf protein alt birimi aşılar gibi preklinik aşamasında bulunmaktadır. Plazmid DNA faz 1 klinik çalışmalarda¹²‘ aşıdır. Emanet değerlendirilmesi ve ZIKV aşı etkinliği, bu nedenle önemlidir. Aşılar bir avantajı ZIKV karşı koruma için önemli olabilir belirli T hücreli yanıt temin için onların yeteneğidir. ZIKV türetilmiş T-hücre epitope ile ilgili tetramers kullanarak, adenovirus vektör tabanlı ZIKV aşı tarafından indüklenen T-hücre immunoreactivity aşılı farelerde tespit edilemedi ve M ve E glikoproteinlerin sağlam antijen spesifik CD8 ikna etmek için gösterildi⁺ T-hücre immunoreactivity¹³.

Bir virüs enfeksiyonu sırasında ana bilgisayar¹⁴korumak için önemli bir T-hücre-aracılı mekanizma MHC kompleksi (MHC) molekülleri için T-hücre reseptör (TCR) tarafından sunulan peptid antijenleri bilinmesidir. Bu teorisi dayalı, tetramer teknoloji antijen spesifik T hücreleri bağışıklık yanıtı¹⁵düzenlenmesinde oynamak rolleri aydınlatmak için eşsiz bir araçtır. Bu iletişim kuralı ZIKV enfeksiyonlar için Ifnar1^{– / –} fare modeli kurulması ve reaktif T hücreleri dalak, beyin ve testis farelerin tespiti tetramer teknolojisini kullanarak açıklar. Ayrıca, ZIKV-E_294-302 tetramer algılamak ve T-hücre immunoreactivity aşılı farelerde ZIKV aşı (AdC7-M/E) tarafından indüklenen değerlendirmek için kullanılır. Bu çalışmada T-hücre yanıt immunoprivileged organlarda soruşturma ile ilgili yönergeler sağlar ve plasenta veya fetal beyin potansiyel uygulamalar için bir referans sağlar.

Protocol

Hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Ulusal Enstitüsü tarafından Viral hastalık kontrol ve önleme, Çin CDC için kabul edildi. Tüm deneyler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanan hayvan iletişim kuralları takip yapıldı. 1. virüs enfeksiyonu Tutmak yetişkin (6-8 haftalık) standart özel durumlarda patojen-Alerjik (SPF), Ifnar1- / – (% 50 erkek ve kadın) fareler ve gıda ve su düzenli erişime izin. Ifnar1- / – fareler ZIKV ile ZIKV 100 µL 1 x 104 odak oluşturan birimler (FFUs) virüs içeren bir fosfat tamponlu tuz (PBS) arabelleği bir retro-orbital aşılama ile enfekte. Benzer şekilde, kontrol fare eşit bir PBS hacmi ile sağlar.Dikkat: ABSL2 koşullar altında fare bulaştırmak ve Biyogüvenlik kabini virüs bulaşmış fareler ile bu işlemleri gerçekleştirmek. Ağırlık ve klinik belirtileri (titreme, sendeleyerek Mart, ikili sarkık hind bacak) fareler her gün 15 gün boyunca izlemek. 2. ZIKV aşısı ile bağışıklama 6 ila 8 hafta-in yaş arasında Ifnar1- / – (% 50 erkek ve kadın) fare kullanın. Fareler standart SPF koşulları 18 – 29 ° C ve 12 h ışık/karanlık döngü erişim ile yiyecek ve su bulundurun. ZIKV aşı ile Ifnar1- / – fareler bağışıklık: AdC7-M/e 100 µL enjekte [4 x 1010 (virüs parçacıkları)] 23-G iğne ile 1 mL şırınga kullanarak bir kas içi enjeksiyon (sohbet yoluyla) yolu ile PBS içinde tampon. Benzer şekilde, kontrol fare eşit bir PBS hacmi ile enjekte et. 3. monosit dalak üzerinden yalıtım Not: Dalak üzerinden monosit yalıtım16daha önce belirtildiği gibi anlatılan. Bir % 5 isoflurane concentrationin % 100 oksijen (ile bir akış hızı 1 L/dak) kullanarak aşılı ve ZIKV enfekte fareler 7 d sonrası aşılama anestezi. Fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi. O zaman, hemen tüm fare % 75 etanol daldırma.Dikkat: Bu adıma ileri doğru tüm deneysel prosedürler aseptik bir Biyogüvenlik kabini yapılmalıdır. İğne kullanarak, (ötenazi, daha önce enfekte/aşı) fareler ekstremitelerin yukarı dönük olacak şekilde karın ile köpük plaka üzerinde düzeltmek. İçin steril neşter ile toraks karın orta çizgi boyunca deriyi kesme, karın kasları makasla kesip, karın boşluğu ortaya çıkarmak ve karaciğer yavaşça çıkarın.Not: Uzun, koyu kırmızı soldaki mide dalak organdır. Dalak kaldırmak, durulayın herhangi bir kan kaldırmak ve 1,5 mL buz gibi Roswell Park Memorial Enstitüsü Orta (RPMI) yerleştirmek için PBS 3 x. Dalak buz üzerinde tutun. Bir tek hücre süspansiyon dalak üretmek için organ(s) bir steril 40 µm gözenekli hücre süzgeç 50 mL tüp üzerine yerleştirin ve buz gibi RPMI orta içeren % 10 fetal Sığır serum (FBS) 2 mL ekleyin. 5 mL şırınga pistonu kullanarak, mekanik olarak organ(s) püre ve orta geçmeden org tam mesh yere ekleyin. Hücre süspansiyon 15 mL tüp aktarmak ve vasıl 600 x g 4 ° C’de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırın. Bir kırmızı kan hücresi (RBC) lizis arabellek (NH4Cl, Na2EDTA ve KHCO3 Tablo reçetesigörmek;) 5 mL içeren hücreleri resuspend ve 5-6 dakika oda sıcaklığında lizis tepki kuluçkaya. Buz gibi RPMI/FBS orta 10 mL ile RBC lizis durdurmak ve tüp vasıl 600 x g 4 ° C’de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırın. Tam RPMI Orta (RPMI ile % 10 vol/vol FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin) 10 mL hücrelerle resuspend. 10 µL hücre süspansiyon için küçük bir tüp transfer % 0,4 wt/vol trypan mavi 10 µL ile karıştırın ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 4. beyin ve testis monosit yalıtım %5 isofluranein % 100 oksijen (ile bir akış hızı 1 L/dak) kullanarak erkek fareler ZIKV enfekte 7 d sonrası aşılama anestezi. Fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi. O zaman, hemen tüm fare % 75 etanol daldırma.Dikkat: Bu adımından itibaren tüm deneysel prosedürler aseptik bir Biyogüvenlik kabini gerçekleştirilmelidir. Monosit beyin ve testis yalıtım17daha önce belirtildiği gibi anlatılan. (Ötenazi, daha önce virüslü) erkek fare yüzükoyun bir kesme tahtası üzerinde hareketsiz. Kafa derisi bir düz 1 x 2 diş forseps ile güvenli ve Iris makas bir ensizyon kafatası ortaya çıkarmak için kafa derisi üzerinde yapmak için kullanın. Yörüngeleri iki yüzü keskin cımbızla klamp ve beyin tamir. Bir ucu keskin Iris makas deliği magnum yerleştirin ve yanal kafatası kesti. Diğer taraf için bu adımı yineleyin. Kullanım dikkatle üzerinden yukarı doğru burun orta hat aynı kavite kesmeye Iris makas keskin. Makas sonuna kadar beyin yaralanmasına önlemek mümkün olduğunca yüzeysel tutmaya çalışın. Beyin forseps ile Asansör ve keskin Iris makas kranial sinir lifleri dikkatle incelemek için kullanın. Forseps ile beyin çıkarın ve buz gibi RPMI/10% FBS orta 5 mL içeren bir 15 mL tüp içinde yerleştirin. Karın deri forseps ile kapmak ve deri ve karın duvarı üzerinden boyuna bir kesi yapmak ve karın altın parçası ortaya çıkarmak için keskin Iris makas kullanın. Testis belgili tanımlık kesme kadar itin. Yavaşça yağ katman cımbızla çekin ve her iki tarafta bir küresel testislerden ortaya çıkarmak. Yağ tabakası ve epididim dikkatle incelemek için kullanın keskin Iris makas. Testis forseps ile buz gibi RPMI/10% FBS orta 5 mL içeren bir 15 mL tüp yerleştirin. Bir tek hücre süspansiyon beyin veya testis üretmek için organ bir steril hücre süzgeç üstünde tepe-in 50 mL tüp 100 µm Fileli yerleştirin ve buz gibi RPMI/10% FBS Orta 2 mL ekleyin. 5 mL şırınga pistonu kullanarak, organ püre ve orta geçmeden org tam mesh yere ekleyin. Hücre süspansiyon 15 mL tüp aktarmak ve vasıl 600 x g 4 ° C’de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırın. 5 mL % 30 yoğunluk gradient orta de içeren hücreleri resuspend ve daha sonra onları çok yavaş 2 mL % 70 yoğunluk gradient orta 15 mL tüp içinde ekleyin. Fren geçiş ve orta katman üzerinden lenfositler vasıl 800 x g 30 dk. elde edilir 4 ° C’de tüpler santrifüj kapasitesi. Interphase taze bir 15 mL tüp transfer için 10 mL soğuk RPMI/10% FBS orta ekleyin ve tüp vasıl 300 x g 4 ° C’de 10 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırın. Buz gibi RPMI/FBS orta 10 mL içeren hücreleri resuspend ve onları vasıl 600 x g 4 ° C’de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırın. Tam RPMI orta 10 mL içeren hücreleri resuspend ve olduğu gibi adım 3.9 hücreleri saymak. 5. tetramer hazırlık H-2Bb biotinylated site etiketi ile ekstrasellüler etki α3 etki alanı ve β2m C terminus üzerinde bir NdeI ve XohI kısıtlama sitesi18ile pET28a vektör kullanarak ifade plazmid oluşturmak. Hızlı ve20daha önce açıklandığı gibi H-2Bb ve β2m dahil organları hazırlar. Renature ve MHC/peptid kompleksi H-2Bb-E294-302arındırmak. 200 mL refolding çözeltisi [100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA-Na, 5 mM GSG ve 0,5 mM GSSG] hazırlamak. Proteaz inhibitörleri ekle: phenylmethylsulphonyl florür (PMSF, stok 100 mM), pepstatin (hisse senedi 2 mg/mL) 100 µL ve leupeptin (hisse senedi 2 mg/mL) 100 µL 2 mL. Arabellek için 30 dk 4 ° C’de ne yapıyorsun? H-2Bb, β2m ve peptid refolding ekleyin. Bir Ģırınga kullanarak guanidin çözeltilerine (30 mg/mL stok) çözünmüş β2m 500 µL enjekte. Bunun için 23 G iğne ile 5 mL şırınga kullanın ve β2m refolding çözüm damla damla içine enjekte. 4 ° C’de 150 devirde yavaş yavaş ve sürekli karıştırarak çözüm tutmak β2m refolding çözüm içinde çözünmüş sonra 2 mg E294-302 peptid DMSO 200 µL içinde çözmek ve hızlı bir şekilde bir pipet kullanarak refolding çözüm içine enjekte etmek. Yavaş yavaş çözüm 150 devirde 15 dakika 4 ° C’de ilave edin. H-2Bb guanidin çözeltilerine çözülmüş 1.5 mL enjekte. 8-10 h için 4 ° C’de H-2Bb refolding için 150 rpm’de dönen heyecan bar tutun.Not: Çözüm soğuk bir odada kapalı bir kutu içinde yerleştirildi. 10 kDa membran ile basınçlı bir odası refolded protein konsantre. Arabellek [20 mM Tris-HCl (pH8.0), 50 mM NaCl] odasına değişimi ve 30-50 mL son bir hacim için konsantre. Refolding çözüm bir santrifüj tüpü aktarmak ve 2500 x g 4 ° C’de 15 dakika de spin Dikkatle süpernatant 10 kDa santrifüj filtre aktarmak ve daha fazla 2.500 x g 30 dk için de 500 µL son hacmi için konsantre. Süpernatant aktarmak için taze bir tüp ve protein S200 ile 12.000 x g 15 dk. arındırmak için de sıralayacağız 10/300 GL filtration Kromatografi jel. MHC kompleksi tepe toplamak ve 350 µL son bir hacim için konsantre. Biotinylation için 500 µL tepki birim oluşturmak için aşağıdaki sıraya göre vekiller ekleyin: çözüm A 100 µL [0.5M bicine (pH 8.3)], 100 µL çözüm B (100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 200 µΜ biotin), ilave d-biotin (500 µΜ biotin) 100 µL , 20 µL BirA enzim (60 µg), pepstatin (2 mg/mL) 0.5 µL ve leupeptin (2 mg/mL) 0.5 µL. Gecede 4 ° C’de tepki tüp kuluçkayaDikkat: herhangi bir EDTA biotinylating tepki eklemeyin. Bir S200 kullanarak MHC arındırmak 10/300 GL jel filtrasyon sütun herhangi bir ilave biotin kaldırmak için. Streptavidin kaymalı tahlil18biotinylating verimlilikle belirlemek. Üç örnek, A, B ve C, buz 30 dk için hazırlayın. Ardından, bir 10 oranında sonuçları çözümleyebilirsiniz SDS-sayfa. Örnek A 8 µL biotinylated MHC molekülleri ve Satım arabellek, örnek B-8 µL biotinylated MHC molekülleri ve streptavidin (20 mg/mL) ve örnek streptavidin (20 mg/mL) 2 µL C ve 8 µL Satım arabellek 2 µL 2 µL oluşur.Dikkat: örnek kaynatın değil. Multimers biotinylated MHC molekülleri oluştururlar. Phycoerythrin etiketli streptavidin bir köstebek oranında tüm biotinylated MHC molekülleri tam bir bağlama emin olmak için 1:5 ile biotinylated E294-302 peptid-H2Db karmaşık karıştırılarak tetramer üretmek. Streptavidin eşlenik tetramerization için gereken miktarını hesaplar. Protein konsantrasyonu ve molar ağırlık için muhasebe MHC/peptid kompleksi moles belirlemek (örnek: Toplam protein 1.8 mg 40 nmol =). MHC/peptid moles 5 tarafından bölünmesi ile gerekli streptavidin eşlenik moles hesaplamak (örnek: 40/5 8 nmol streptavidin eşlenik =). Streptavidin (µg) gerekli miktarını hesaplamak streptavidin eşlenik bağlı olarak (örnek: streptavidin-PE [300.000 g/M] → 8 gerekli nmol = 2.400 g). Streptavidin-phycoerythrin 10 örnekleri bölün. Her örnek biotinylated E294-302 peptid-H2Db karmaşık, 20 dk aralığını içeren bir tüp ekleyin. Son örnek yükledikten sonra bir gecede karanlıkta 4 ° C’de tepki tüp kuluçkaya. Multimerized reaktifler bir 100 kDa spin tüpüne uygulamak ve 2.000 x g 4 ° c bir hacmi ile de Santrifüjü tarafından konsantre < 100 µL. Spin tüp 4 ml PBS (pH 8.0) kullanarak örnek sulandırmak ve tekrar konsantre < 100 µL. Arabellek Satım adım PBS (pH 8.0) tekrar 4 x. 500 toplam birime tekrar doldurmak µL PBS (pH 8.0) kullanarak. Örnek 2-2,5 mg/mL tahmini bir konsantrasyon için 2.000 x g 4 ° C’de, konsantre Örnek 4 ° C’de karanlıkta saklamak 6. akış sitometresi Anti-antikorundan CD16/CD32 Fc-reseptör engelleme reaktif 20 µL (seyreltme faktörü 1: 200) 10 dakika başına 0.1 µL ile 4 ° C’de (Kimden adım 3,9 ve/veya adım 4,15) hücre süspansiyonlar belirsiz herhangi bir bağlama önlemek için kuluçkaya. 20.000 x g için en az 15 dk 4 ° C’de de tetramer tüp santrifüj kapasitesi Hücre süspansiyon 20 µL her şey bir 96-şey platecontaining 1 x 106 hücrelere ekleme. Yeterli bir birim tüm deneysel tüpler leke E294-302 tetramer karışımı hazırlayın. Bu karışımı hesabına toplam hacminin % 15 aşırı pipetting hatalar için hazırlayın. FACS arabelleği (2 mg/mL, 1 µL/testi) E294-302 tetramers seyreltik (PBS, % 0.5 FBS) böylece 20 µL E294-302 tetramer karışımı her teste eklenir. E294-302 tetramer Mix 20 µL 96-şey plakasına ekleyin. Bu adımı yılı sonuna kadar her şey son hacim 40 µL.Incubate plaka karanlıkta 30 dk için oda sıcaklığında olmalıdır. Birincil antikorlar (FITC Birleşik veya APC Birleşik anti-CD3 (0.2 mg/mL), PerCP-Birleşik anti-CD8 (0.2 mg/mL)) 1 µL/testi hücre süspansiyon ekleyin ve sonra 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için 4 ° C’de kuluçkaya. Hücreler 2 yıkama x 2 mL FACS arabellek ve 600 x g 5 dakika süreyle şunlara dikkatlice süpernatant Aspire edin ve 200 µL FACS arabelleği hücrelerle resuspend santrifüj ile. Geçici olarak 4 ° C’de örnekleri karanlıkta akış sitometrik çözümlemesi kadar saklayın. Aşağıdaki gating strateji akış sitometrik çözümleme için kullanın. Bir kapı üzerinde çapraz olarak kümelenmiş gömlek bir ileri dağılım (FSC) karşı tarafı dağılım (SSC) alan komplo tarafından oluşturun. O zaman, CD3 üzerinde kapı+ hücreleri yan dağılım (SSC) karşı tarafından CD3; ardından, CD3 üzerinde kapı+ CD8+ hücreleri; son olarak, CD8 anahat+ tetramer+ hücreleri19. 7. histopatoloji, ayirt ve immünhistokimya tahlil Histopatoloji tahlil ZIKV-enfekte Ifnar1- / – fareler 7 d sonrası aşılama beyin ve testis dokuların toplamak ve onları %4 tarafsız tamponlanmış formaldehit düzeltmek.Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun kişisel koruyucu ekipman giymek. Doku içinde parafin gömün. 5 mm bir vibratome kullanarak doku bölüm. Hematoksilen eozin (H & E) ile doku leke. İmmünhistokimya tahlil Deparaffinize, suyla temasa ve antijen-doku almak ilgili yordamlar dayalı bölümlerde anlatıldığı daha önce21. Doku bölümleri 10 min için % 3 H2O2 PBS (pH 7,6) ile tedavi ve % 1 sığır serum albumin (BSA) 10 dakika ile engellemek. Fare Anti-fare CD3 antikor doku bölümlerle kuluçkaya (seyreltme: 1/1000) Oda sıcaklığında 8 h ve sonra onları gecede 4 ° C’de kuluçkaya. PBS kurcalayarak durulama ve sonra onları biotinylated ikincil antikor ile 3 damla kuluçkaya (seyreltme: 1/1000) Oda sıcaklığında 2 h için takip avidin-biotin-peroksidaz tarafından 3 damla (seyreltme: 1/200), oda sıcaklığında 30 dakika. Bağlama, 30, 3 damla ile 30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (seyreltme: 1/1000),22daha önce açıklandığı gibi. Mayer’ın hematoksilen doku bölümlerle counterstain. Ayirt tahlil Donmuş testis bölümleri (6 mm) için oda sıcaklığında 10 dakika kuruması. 10 dakika buz gibi soğuk aseton ile düzeltmek. PBS bölümlerle 3 x için yıkama ve bunları engelleme bir arabellek ile engellemek (%1 BSA, % 0.3 Triton, 1 x PBS) 30 dk 37 ° C’de. Birincil antikor (Z6) doku bölümlerle kuluçkaya (20 µg/mL) 4 ° C’de bir gecede. PBS kurcalayarak durulama ve ikincil antikor uygulamak (seyreltme faktörü: 1/200) 37 ° C’de 1 h için PBS doku bölümlerle yıkama ve onları 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak çekirdekler için counterstain (seyreltme faktörü: 1/1000), üreticinin yönergeleri izleyin.

Representative Results

Bu yöntemler ZIKV enfeksiyonlar için bir fare modeli geliştirdik. Ifnar1- / – fareler 6 – 8 hafta-in yaş, 1 x 104 odak oluşturan birimler ile (FFU) ZIKV retroorbital enjeksiyonu ile bulaşmış. Patolojik belirtiler ve işaretleri (Şekil 1A) yanı sıra kilo değişiklikleri (Şekil 1B), Ifnar1- / – fareler ZIKV ile bir enfeksiyon sonra tespit edildi. Fare beyni belirgin ödem ve hiperemi (Şekil 1C) gösterdi. Bu arada, testis yavaş yavaş küçüldü (Şekil 1D). Ayrıca, patolojik değişiklikler ve doku imha beyin ve testis (Şekil 2A) bulunamadı. ZIKV beyin ve testis (Şekil 2B) algılamak için bir ayirt tahlil yapılır. Viral yük beyin ve testis immunostaining (resim 2B) tarafından tespit edildi. İmmünhistokimya gösterdi CD3 sağlam bir infiltrasyonu+ T hücreleri farelerin beynine ZIKV (Şekil 2C) ile enfeksiyon sonra. Bir fare MHC hazırladığımız algılamak ve ZIKV özgü T-hücre yanıtları değerlendirmek için-ben H-2Bb-E294-302 tetramer. 294-302 peptid E ve H-2Bb renature düzgün yardımcı olabilir çözünür MHC yüksek miktarda verim-ı (Şekil 3A). Üst karakter tahlil biotinylation yüksek bir verimlilik (Şekil 3B) gözlenen. Daha sonra üç streptavidin Floresan (APC, PE ve BV421) – pMHC öğesini – ben tetramers ZIKV özgü T hücreleri (Şekil 3C) algılamak için üretildi. PE etiketli tetramer belirli CD8 algılamak için daha yüksek bir etkinlik vardı+ T hücre fark istatistiksel olarak anlamlı değildi ama APC ve BV421 etiketli tetramers için karşılaştırıldığında. E294-302 tetramer kullanarak, ZIKV özgü T lenfositleri enfekte fareler dalak ZIKV (3.49 ± % 0.45) 7 d sonrası aşılama, akış sitometresi tarafından tespit ettik. Ayrıca, benzer şekilde, bölümünde bu iletişim kuralı, 4 hafta sonrası aşılama ile AdC7-M/E aşısı 3 açıklanan yöntemi, ZIKV özgü T lenfositler dalak (%1,36 6,89 ±) tespit edildi (Şekil 4). Ayrıca, ZIKV enfeksiyon sonra beyin ve testis, gibi immunoprivileged organları içine sızmış lenfositler tespit ettik. Kapıları CD3 için seçmek için ayarlanmış+CD8+ T hücreleri, beyin ve testis toplam lenfosit. Yüksek bir oranı E294-302 tetramer özgü T hücrelerinin beyinde tespit edilemedi (CD3 .2+CD8+ T hücreleri) ve testis (CD3 ,4+CD8+ T hücreleri) lenfositler (Şekil 5). Resim 1 : Ifnar1- / – farelerde ZIKV enfeksiyon karakterizasyonu. Ifnar1- / – fareler 6 – 8 hafta-in yaş, ZIKV retroorbital iğne ile 104 odak oluşturan birim ile (FFU) enfekte ve PBS ile enjekte fareler hastalık bulaşmamış tek denetimleri kullanılmıştır. (A)Morfoloji ve (B) ağırlık değişiklikleri- / – virüslü Ifnar1 farelerin takip. Kırmızı oklar, Ifnar1- / – fareler myeloparalysis ve motor paraparesis ile enfeksiyon sonra sunulan gösterir. (C) beyin 7 d sonrası aşılama ve (D) testis 0, 7, 14 ve 30 gün sonrası aşılama hasat edildi. Beyin ve testis fareler gelen temsilcisi görüntüleri boyutlarını belirtmek için bir cetvel ile gösterilir. Hata çubukları ortalama ± SEM n temsil başına deney grubu başına 10 fare =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 :, ZIKV ve beyin ve testis ZIKV enfekte Ifnar1- / – farelerin lenfosit. (A) Bu panel gösterir histopatolojik değişiklikler beyin ve testis ZIKV enfekte fareler negatif hakim olmak vasıl 7 d sonrası aşılama ile karşılaştırıldığında üzerinden. Ölçek çubuğu = 25 µm (sol paneli) ve 50 µm (doğru kapı aynası). (B) bir ayirt tahlil anti-ZIKV Z6 antikor (yeşil) gerçekleştirildi. Bütün doku örneklerinde ZIKV enfekte fareler, 7 d sonrası aşılama üzerinden toplanmıştır. Çekirdeklerin DAPI ile (mavi) lekeli. Ölçek çubuğu 50 µm. (C) immünhistokimya gösterir CD3 sağlam bir infiltrasyonu =+ T hücreleri beyin ve testisin içine. Ölçek çubuğu = 25 µm (sol paneli) ve 50 µm (doğru kapı aynası). Mor hematoksilen gösterir, kahverengi CD3 antikor temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : ZIKV özel pMHC hazırlanması-ben tetramers. (A) E294-302 H-2Bb için bağlayıcı aydınlatılmamıştır vitro refolding tarafından. Mavi H-2Bb-E294-302 protein gösterir. Turuncu peptid olmadan olumsuz denetim temsil eder. (B) Bu panel H-2Bb-E294-302 üst karakter tahlil gösterir. (C) sahte bir PBS denetim temsil eder. Üç streptavidin Floresan (APC, PE ve BV421) – pMHC öğesini – ben tetramers ZIKV özgü T hücreleri tespit etmek için kullanılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : Virüs özgü CD8 sitometrik analizinde akışı + ZIKV-enfekte ve aşı-aşı fareler dalak T hücreleri. 6-8 hafta-in yaş, Ifnar1- / – fareler bir tek doz 4 x 1010 viral parçacıkların AdC7-M/E veya PBS bir negatif kontrol olarak alınan veya 104 odak oluşturan birim ile (FFU) ZIKV da bulaşmış. 7 gün sonrası enfeksiyon veya 4 hafta sonrası aşı sonra fare splenocytes hasat ve akış sitometresi tarafından analiz. Ortalama ± SD istatistiksel analiz tek yönlü ANOVA kullanarak gerçekleştirilen gibi verileri görüntülenir (önemli değil: P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ***P < 0.0001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.  Şekil 5 : Virüs özgü CD8 strateji ve temsilcisi sonuçlarını çoğunluğuna+ T Beyin ve testis farelerin ZIKV enfekte hücreleri. Beyin ve (B) testis temsilcisi araziler infiltre lenfositler(a)için gösterilir. Gates bir arkaya lenfoid-dağılım+ ve CD3 seçmek için küme+ olaylar. Bu, CD8+ olaylar epitope özgü T hücre analizi için geçişli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Discussion

İmmunojenik T hücreli epitope hücresel bağışıklık patojenlere²³karşı önemli bir rol oynar. Böylece, ZIKV özgü T hücreleri immunoprivileged organlarda tespiti doğal ZIKV bulaşmasına karşı T hücreli yanıt-e doğru anlamak için kritik bir metodoloji olduğunu. Bu arada, T-hücre yanıt algılama viral aşı etkinliği araştırmak için mükemmel bir araçtır. İşte, dalak, beyin ve testis ZIKV enfekte farelerin, immunodominant epitope E_294-302 tetramer hazırlanması lenfositlerin yalıtım içeren deneyler, görselleştirmek için kapsamlı bir protokol göstermektedir ve ZIKV özgü CD8 tanınması⁺ T hücreleri immunoprivileged fareler ZIKV etkilenmiş organlarda.

Bir önceki çalışma canlı bir ZIKV veya kendi RNA ZIKV kan-testis bariyeri atlamak ve üreme sistemi²⁴saat içinde kendisini çoğaltmak belirten meni erkek hastaların içinde algılanabilen gösterdi. Daha önce biz de ZIKV testis hasarına neden ve fareler²⁵erkek kısırlığı yol gösterdi. ZIKV enfeksiyon viremi rhesus maymunları içinde yol açabilir ve viral RNA viseral organlar yanı sıra, merkezi sinir sistemi (MSS) tespit edilebilir. İmmünhistokimya ZIKV özgü antijenlere MSS ve birden çok periferik organlarda²⁶sunuldu ortaya koydu. Ayrıca, fare modellerinde, sağlam bir antiviral CD8 ZIKV enfeksiyon neden olabilir⁺ T hücre yanıt olarak dalak ve CNS²⁶.

Önceki çalışmaya göre bu çalışmada ZIKV özgü CD8 algılamak için sistematik yöntemleri kurar⁺ T hücre yanıt beyin ve testis, immunoprivileged sitelerdir. Virüs özgü T hücreleri ZIKV enfekte farelerin immunoprivileged organlarında işlevselliğini değerlendirmek önemlidir. ZIKV özgü CD8 algılamak için tetramers kullanımını⁺ T-hücre immunoprivileged organlarda yanıt büyük ZIKV enfeksiyonlar ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtlarını anlayışımızı geliştirmek. E_294-302 tetramer kullanarak, virüs özgü T hücrelerinin beyin ve testis akış sitometresi tarafından koruma ve immunopathogenesis hücresel mekanizmaları ZIKV enfeksiyon sırasında araştırmak için izole. Bu arada, araştırmacılar CD8 fonksiyonları daha ayrıntılı araştırmaya yardımcı olur⁺ T hücreleri ZIKV kontrol etmek veya bu organların immunopathogenesis ZIKV enfeksiyon sırasında geliştirmek için.

Antijen spesifik fare CD8 analiz etmek için⁺ T hücre yanıt-e doğru immunoprivileged organlarda H-2B^b-E_294-302 tetramer hazırlanan ve CD8 tespit⁺ T hücreleri tarafından akış sitometresi. Tetramers antijen spesifik T hücreleri tespit etmek için güçlü bir araç vardır. Burada, fluorochrome Birleşik streptavidin (APC, PE ve BV421) üç tür üretildi. APC, BV421 ve PE etiketli tetramers antijen spesifik T hücreleri, PE etiketli pMHC saptamak için hiçbir istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar olsa da-ben tetramers en iyi sonuçlar vermiştir. Bu nedenle, PE etiketli tetramer bu çalışma kullanıldı. İlginçtir, PE etiketli H-2B^b-E_294-302 tetramer üzerinde bağlı olarak, yüksek oranda antijen spesifik T hücrelerinin beyin ve geçiş yeteneği için kandan virüs özgü T hücrelerinin belirtmek testis tespit ettik immunoprivileged organları.

Ancak, bazı sınırlamalar Protokolü vardır. H-2B^b-E_294-302 tetramer tetramer algılama MHC sınırlama üstünde bağlı olduğundan insan T-hücre algılama için kullanışlı değildir. İmmunodominant HLA-sınırlı peptidler tarama hala gereklidir. Ayrıca, retro-orbital enfeksiyonu ZIKV enfeksiyonu için etkilidir ama bazı araştırmacılar için uygun bir işlem olmayabilir. Böylece, enfeksiyon, periton, subkutan veya intravenöz, dahil olmak üzere diğer yolları da önerilir.

Burada açıklanan protokolünde monositler beyin ve testis yalıtım kritik bir adımdır. Yüksek kaliteli lenfositler elde etmek önemlidir; Bu nedenle, örneğin, radyal hız, taşlama doku gücünü ve beyin ve testis dokusu diseksiyon dikkat etmek önemlidir. Ayrıca, için tetramer hazırlık, proteaz inhibitörleri (PMSF, pepstatin, leupeptin) bir protein bozulmuş üzerinden korurken yardımcı olur. Bu nedenle, bir proteaz inhibitörü refolding arabelleğe ekleyin ve arabellek tetramer hazırlama işlemi sırasında değişimi için mantıklı.

Sonuç olarak, biz Ifnar1^{– / –} fare modeli immunoprivileged organları için bir ZIKV enfeksiyon antijen spesifik T hücreli yanıt-e doğru saptamak için yöntemler mevcut. Bu platform yaygın olarak ortaya çıkan ve virüs hangi kan ve immunoprivileged organları arasındaki engelleri atlayabilir yeniden ortaya çıkan bağışıklık mekanizmaları araştırmak için uygulanabilir. Ayrıca, bu çalışmada gelecek gelişmeye aday aşılar ve immunotherapies önünü.

Materials

Z6	our lab		Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3	Santa Cruz	sc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L)	ZSGB-BIO	ZF-0308
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated	CWBIO	CW0115
FITC anti-mouse CD3	Biolegend	17A2
APC anti-mouse CD3	Biolegend	100236
PerCP anti-mouse CD8a	Biolegend	100732
Percoll	GE Healthcare	P8370
PMSF	Ameresco	0754-5G	Toxic and corrosive reagent. Handle with care
Streptadivin	BD	S4762-FZ	Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and  stored at -20 °C
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG	5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20ºC
Leupeptin	Sigma	L8511	5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at – 20ºC
Peptides	Scilight-peptide		Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C
RPMI 1640	Hyclone	SH30809.01	Must be stored at 4°C
DMSO	MP	219605590	Store at room temperature.
APC-Streptadivin	BD	554067	Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze.
FITC-Streptadivin	BD	554060	Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze.
PE-Streptadivin	BD	554061	Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze.
BV421-Streptadivin	BD	563259	Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze.
PageRuler Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Must be stored at 4°C
Cell Strainers	BF	BF10-5040	Store at room temperature.
Amicon Ultra 100kDa	Millipore	UFC510024	Store at room temperature.
Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific
FACS Cantol			Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE healthcare	28990944
AKTA PURE	GE healthcare
red blood cell lysis buffer	Solarbio	R1010	Store at 4°C.