En protokoll for å evaluere antigen-spesifikke T-celle svar i immunoprivileged organer i Ifnar1– / – murine modellen for Zika virusinfeksjonen (ZIKV) er beskrevet. Denne metoden er avgjørende for å undersøke mobilnettet mekanismer for beskyttelse og immunopathogenesis av ZIKV vaksiner og er også verdifull for deres effekt evaluering.
Zika viruset (ZIKV) kan indusere betennelse i immunoprivileged organer (f.ekshjernen og testikkel), fører til Guillain-Barrés syndrom og skade testiklene. Under en infeksjon med ZIKV, har immunceller vist å infiltrere inn i vev. De cellulære mekanismene som definerer den beskyttelse og/eller immunopathogenesis av disse immunceller under en ZIKV infeksjon er imidlertid fortsatt hovedsakelig ubekjent. Her beskriver vi metoder for å evaluere funksjonen virus-spesifikke T-celle i disse immunoprivileged organer ZIKV-infiserte mus. Disse metodene omfatter en) en ZIKV infeksjon og vaksine inoculation i Ifnar1– / – mus; b) histopatologi, immunofluorescence og immunohistochemistry analyser å oppdage virusinfeksjon og betennelse i hjernen, testiklene og milt; c) utarbeidelse av en tetramer av ZIKV-avledet T-celle epitopes; d) oppdagelsen av ZIKV-spesifikke T celler i monocytter isolert fra hjernen, testiklene og milt. Bruke disse metodene, er det mulig å oppdage antigen-spesifikke T celler som har infiltrert i immunoprivileged organer og evaluere funksjonene til disse T-celler under infeksjon: potensielle immun beskyttelse via virus klarering og / eller immunopathogenesis til å forverre betennelse. Disse funnene kan også bidra til å avklare bidrag av T-celler av immunisering mot ZIKV.
ZIKV er en mygg-borne flavivirus som først ble isolert i 1947 i Uganda fra en febril rhesus macaque. ZIKV har nylig blitt en public health emergency, på grunn av sin raske spredningen i Amerika og uventet koblingen microcephaly og Guillain-Barrés syndrom1,2,3. Fra epidemiologiske data, har ZIKV vært mistenkt å være årsaken til Guillain-Barrés syndrom i rundt 1 per 4000 infisert voksne4. Videre har en sammenheng mellom ZIKV og testiklene infeksjon/skaden i musemodell vist, antyder at ZIKV infeksjon, under visse omstendigheter, kan omgå blod-testikkel barriere og føre til mannlig infertilitet5 . Disse funnene markere betydningen av helt forstå induksjon av beskyttende eller patologisk immunreaksjoner under en ZIKV infeksjon.
Mye fortsatt for å lære om cellular immun svar i ZIKV. CD4+ og CD8+ T-celle svar til kapsid, konvolutt og nonstructural protein 1 (NS1) har blitt observert i ZIKV-infiserte aper og mennesker6,7,8. I mus, flere studier har indikert at CD8+ T celler spiller en beskyttende rolle i å kontrollere den ZIKV replikering9,10,11. Viktigere, Jurado et al. viste at en ZIKV infeksjon resulterer i nedbrytning av blod – hjerne barrieren og perivascular infiltrasjon av CD8+ effektor T celler i prøvene av Ifnar1– / – mus. Videre, de viste at CD8+ T celler egge ZIKV-assosiert lammelse og synes å spille en rolle i neonatal hjernen immunopathology. I en tidligere studie, vi forberedt ZIKV-E294-302 tetramer og viste at ZIKV-spesifikke CD8+ T celler finnes i hjernen og spinal snorer av ZIKV-infiserte Ifnar1– / – mus, som kan ha viktige implikasjoner for design og utvikling av ZIKV vaksiner10.
Svar på det presserende behovet for vaksinering å forebygge ZIKV infeksjon, er flere vaksiner i preklinisk stadier av utvikling, inkludert RNA vaksiner rekombinant vektorbasert vaksiner og renset protein delenhet vaksiner. Plasmider DNA vaksinen er i fase 1 kliniske studier12. Evalueringen av sikkerhet og effekt av ZIKV vaksiner er derfor viktig. En fordel av vaksiner er deres evne til å lokke fram bestemte T-celle svar, som kan være viktig for beskyttelse mot ZIKV. Ved å bruke ZIKV-avledet T-celle epitope-relaterte tetramers, T-celle immunoreactivity av en adenovirus-vektorbaserte ZIKV vaksine kan oppdages i vaksineres mus, og både M og E glykoproteiner ble vist å indusere robust antigen-spesifikke CD8+ T-celle immunoreactivity13.
Under en virusinfeksjon er anerkjennelse av peptid antigener presentert av store histocompatibility kompleks (MHC) molekyler til T-celle reseptor (TCR) en viktig T-celle-mediert mekanisme for å beskytte de vert14. Basert på denne teorien, er tetramer teknologi et unikt verktøy å belyse rollene som antigen-spesifikke T celler spille i å regulere immunreaksjoner15. Denne protokollen beskriver etableringen av Ifnar1– / – musemodell for ZIKV infeksjoner, og oppdaging av reaktive T celler i milten, hjernen og testiklene av mus ved hjelp tetramer teknologi. I tillegg har vi brukt ZIKV-E294-302 tetramer å finne og evaluere T-celle immunoreactivity av en ZIKV vaksine (AdC7-M/E) i vaksineres mus. Denne studien gir veiledning for å undersøke T-celle svar i immunoprivileged organer og gir en referanse for potensielle programmene i morkaken eller fosterets hjerne.
Immunogenic T-celle epitope spiller en betydelig rolle i cellulære immunitet mot patogener23. Dermed er gjenkjenning av ZIKV-spesifikke T celler i immunoprivileged organer en viktig metode for å forstå T-celle svar mot infeksjon naturlig ZIKV. I mellomtiden er T-celle respons oppdagelsen et utmerket verktøy for å undersøke effekten av viral vaksinen. Her viser vi en omfattende protokoll for å visualisere eksperimenter, som omfatter isolering av lymfocytter fra milt, hjernen og prøvene av ZIKV-infiserte mus, utarbeidelse av immunodominant epitope E294-302 tetramer, og anerkjennelse av ZIKV-spesifikke CD8+ T celler i immunoprivileged organer ZIKV-infiserte mus.
En tidligere studie viste at en live ZIKV eller dens RNA kan påvises i sæd av mannlig pasienter, som indikerer at ZIKV kan omgå blod-testikkel barrieren og formere seg i reproduksjonssystemet24. Tidligere viste vi også at ZIKV kan skade testiklene og føre til mannlig infertilitet i mus25. ZIKV infeksjon kan føre til viremia i rhesus aper og viral RNA kan oppdages i sentralnervesystemet (CNS) og visceral organer. Immunohistochemistry viste at ZIKV-spesifikke antigener ble presentert i CNS og flere eksterne organer26. Også i murine modeller, ZIKV infeksjon kan indusere en robust antiviral CD8+ T-celle respons i milten og CNS26.
Sammenlignet med tidligere arbeid, denne studien etablerer systematisk metoder for å oppdage ZIKV-spesifikke CD8+ T-celle svar i hjernen og testiklene, som er immunoprivileged. Det er viktig å vurdere funksjonaliteten til virus-spesifikke T celler i det immunoprivileged organer av ZIKV-infiserte mus. Bruk av tetramers å oppdage ZIKV-spesifikke CD8+ T-celle svar i immunoprivileged organer vil kraftig forbedre vår forståelse av ZIKV infeksjoner og deres vert immunreaksjoner. Bruker E294-302 tetramer, kan virus-spesifikke T celler i hjernen og testikkel være isolert av flowcytometri, for å undersøke mobilnettet mekanismer for beskyttelse og immunopathogenesis under en ZIKV infeksjon. I mellomtiden er det nyttig for forskere å undersøke ytterligere funksjoner i CD8+ T celler til å kontrollere ZIKV eller å forbedre immunopathogenesis i disse organene under ZIKV infeksjon.
Analysere antigen-spesifikke murine CD8+ T-celle svar immunoprivileged organer, vi forberedt H-2Db-E294-302 tetramer og oppdaget CD8+ T celler av flowcytometri. Tetramers er et kraftig verktøy for å oppdage antigen-spesifikke T-celler. Her ble tre typer fluorochrome-konjugerte streptavidin (APC, PE, og BV421) generert. Selv om det er ingen statistisk signifikante forskjeller i APC-, BV421- og PE-merket tetramers for å oppdage antigen-spesifikke T-celler, PE-merket pMHC-jeg tetramers ga best resultat. Derfor ble tetramer PE-merket brukt i denne studien. Interessant, basert på PE-merket H-2Db-E294-302 tetramer, vi har oppdaget høye prosenter av antigen-spesifikke T-celler både i hjernen og testiklene, som indikerer migrasjon muligheten for virus-spesifikke T-celler fra blodet immunoprivileged organer.
Det er imidlertid noen begrensninger for protokollen. H-2Db-E294-302 tetramer er ikke nyttig for menneskelige T-celle gjenkjenning, fordi tetramer påvisning er avhengig av MHC begrensning. Screening av immunodominant HLA-begrenset peptider er fortsatt behov. Dessuten retro-orbital infeksjon er effektive for en ZIKV infeksjon, men kan være ikke en praktisk drift for noen etterforskere. Dermed anbefales andre ruter på infeksjon, inkludert peritoneal, subkutan eller intravenøs, også.
I protokoll beskrevet her, er en avgjørende skritt isolering av monocytter fra hjernen og testikkel. Det er viktig å få høy kvalitet lymfocytter; Derfor er det viktig å ta hensyn til, for eksempel sentrifugal hastighet, styrke sliping vevet og Disseksjon av hjernen og testikkel vev. Dessuten på tetramer forberedelser er proteasehemmere (PMSF, pepstatin, leupeptin) nyttig når beskytte et protein blir dårligere. Derfor er det fornuftig å legge til en protease hemmer refolding bufferen og bytte bufferen under prosessen med tetramer utarbeidelse.
I konklusjonen, presenterer vi metoder av oppdager antigen-spesifikke T-celle svar i immunoprivileged organer i Ifnar1– / – musemodell for en ZIKV infeksjon. Denne plattformen kan bli mye brukt for å undersøke immun mekanismer for nye og gjenoppstå virus som kan omgå barrierene mellom blod og immunoprivileged organer. Videre, denne studien kan bane vei for den fremtidige utviklingen av kandidaten vaksiner og immunotherapies.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Gary Wong for engelsk revisjon. Dette arbeidet ble støttet av National nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (grant 2017YFC1200202), den store spesielle prosjekter for smittsomme sykdommer forskning i Kina (grant 2016ZX10004222-003). George F. Gao er en ledende viktigste etterforsker National Natural Science Foundation av Kina nyskapende forskningsgruppe (grant 81621091).
Z6 | our lab | Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510 | |
CD3 | Santa Cruz | sc-1127; RRID: AB_631128 | |
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) | ZSGB-BIO | ZF-0308 | |
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated | CWBIO | CW0115 | |
FITC anti-mouse CD3 | Biolegend | 17A2 | |
APC anti-mouse CD3 | Biolegend | 100236 | |
PerCP anti-mouse CD8a | Biolegend | 100732 | |
Percoll | GE Healthcare | P8370 | |
PMSF | Ameresco | 0754-5G | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
Streptadivin | BD | S4762-FZ | Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and stored at -20 °C |
Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | 5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20ºC |
Leupeptin | Sigma | L8511 | 5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at – 20ºC |
Peptides | Scilight-peptide | Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C | |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | Must be stored at 4°C |
DMSO | MP | 219605590 | Store at room temperature. |
APC-Streptadivin | BD | 554067 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
FITC-Streptadivin | BD | 554060 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PE-Streptadivin | BD | 554061 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
BV421-Streptadivin | BD | 563259 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PageRuler Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Must be stored at 4°C |
Cell Strainers | BF | BF10-5040 | Store at room temperature. |
Amicon Ultra 100kDa | Millipore | UFC510024 | Store at room temperature. |
Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
FACS Cantol | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | ||
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE healthcare | 28990944 | |
AKTA PURE | GE healthcare | ||
red blood cell lysis buffer | Solarbio | R1010 | Store at 4°C. |