陰イオン交換樹脂を用いるバイオエアロゾルからのウイルスの検出
Summary
陰イオン交換樹脂ベース方法、ウイルスのバイオエアロゾルの衝突によるサンプリングを示した液体に適応します。下流分子の検出と相まって、メソッドはバイオエアロゾルからのウイルスの簡便かつ高感度検出できます。
Abstract
このプロトコルは、ウイルスのカスタマイズされたバイオエアロゾル サンプリング メソッドを示します。このシステムでは、負荷電のウイルスの効果的な濃度の液体の衝突に基づく空気サンプリング装置をバイオエアロゾルから陰イオン交換樹脂が結合されます。したがって、樹脂はバイオエアロゾル サンプリング ワークフローの添加濃度ステップとして機能します。ウイルス粒子の核酸抽出が陰イオン交換樹脂、分子解析に適した結果サンプルから直接実行されます。さらに、このプロトコル記述特注バイオエアロゾルの商工会議所の様々 な環境条件や温度、湿度などの環境変数の連続的な監視を可能にするの下でウイルスを含んだバイオエアロゾルを生成する能力が風の速度、およびエアロゾル質量濃度。このプロトコルを使用しての主な利点は、そのまま従来液体リンカーンインピン ジャーへの直接比較によって評価ウイルス検出の感度の向上です。その他の利点には、多様な負荷電ウイルス、陰イオン交換樹脂 (サンプルあたり ~$0.14)、使いやすさと低コストを集中する可能性があります。デメリットがこのプロトコルの樹脂に吸着したウイルス粒子の感染性を評価できないと液体サンプリング バッファーの最適化の必要性が、インピン内で使用される可能性があります。
Introduction
このメソッドの目的は、バイオエアロゾルからのウイルスの負荷電の分子の検出を容易にする高感度バイオエアロゾル サンプリング プラットフォームを提供することです。微生物、ウイルス粒子を含むバイオエアロゾルの時間1の長時間生き残ることができます。バイオエアロゾル比較的長距離移動し、冷却塔の影響を受けた個人から 6 km の距離に位置する工業に由来するレジオネラ症の発生によって証明されるように発芽力と感染力を維持し、18 死亡者2で起因しました。人間バイオエアロゾルを介したウイルスの間接感染は複数の設定で発生することができ、学校やレストランの3,4におけるノロウイルス感染アウトブレイクの実証されています。同様に、ウイルスのバイオエアロゾル伝送生産設備5,間のウイルスの動きの主要な要因と見なされているこの経路で豚や家禽農場で農業設定で発生する可能性6,7,8,9。
どの h5 型インフルエンザ ウイルスが検出された生きている動物のバイオエアロゾル市場中国でのデモで示すように、迅速な診断と発生防止のための対策の改善のためウイルスを含んだバイオエアロゾルの効果的なサンプリングを可能とアメリカ合衆国の10、11。現在バイオエアロゾル サンプリング技術は異なるパーティクル キャプチャ原則の数を含む、インピン、サイクロン、インパクター、およびフィルター12に広く分類することができます。それはこのプロトコルのすべての利点を余すところなくカバーするの範囲とバイオエアロゾル; からウイルスのサンプリングのためのこれらのプラットフォームのデメリットを超えてただし、これらのサンプリング デバイスの大半がウイルスやバクテリオファージ13コレクションの最適化されていない記述できます。さらに、液体のインピン固体インパクターやフィルター14などのデバイスのサンプリングよりもより効果的にウイルスの感染性を維持するために考えと、ウイルス粒子の感染はしばしば否定的影響します。液体の衝突の 1 つの欠点はターゲットの希釈効果、ウイルスにコレクションの容器内の液体の比較的大きなボリューム (通常 ≥20 mL) で収集するために発生します。もう一つの重要な欠点を含む粒子を濃縮する液体インピンの最適効率 < サイズ150.5 μ M。ただし、固定は、ウイルス核酸とウイルス感染16,17の保存を高めることができるとこれらの装置の捕集効率を固体マトリックスに固定化によって改善できます。
我々 は以前陰イオン交換樹脂がキャプチャと F RNA バクテリオファージ、A 型肝炎ウイルス、ヒト アデノ ウイルスやロタウイルス18,19 を含む液体の行列からのウイルスの集中のための効果的なツールであることを示しています。 ,20。製造元によって定義された、本研究で陰イオン交換樹脂は機能性第四紀アミン グループの仲介する魅力と21液中の陰イオンのキャプチャ用いたポリスチレン強基本陰イオン交換樹脂.その結果、陰イオン交換樹脂は、net 負の表面電荷、多く腸管系ウイルス、インフルエンザ ウイルス、公共と動物の健康に関連するその他のウイルスなどのウイルスをキャプチャする予定です。
現在のプロトコルは、液体インピンに陰イオン交換樹脂の付加を含みます。このシステムでは、樹脂はインピン液体で捕獲したウイルス粒子のセカンダリ濃度ステップとして機能します。核酸は、小さなボリューム、分子解析の集中のサンプルを提供することで直接溶出することができます。したがって、このメソッドの主な利点は、主にサンプル量の削減を通じて、ウイルス検出感度の改善です。さらに、ウイルスの負荷電の固有の非特異的キャプチャ、ためメソッドは可能性があります興味のあるウイルスの大規模な数の検出のために適当。ここでは、メソッドは、ワクチン株の A 型と B 型のインフルエンザ ウイルスと FRNA ファージ MS2 (MS2) に示されています。これらのウイルスでは、前述の22として標準 qRT PCR の試金を使用して検出されます後。エンドポイント ユーザーは困難に遭遇、このメソッドを実行するために期待しないでください現在既存の修正装置はバイオエアロゾル サンプリング及び分析の従来の流れに大きな混乱を構成しません。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、使用変更された液体インピン バイオエアロゾルから機密のウイルス キャプチャする方法をについて説明します。メソッドは、バイオエアロゾルのウイルス負荷の検出と定量に最適です。ここに示す特定の変更は、一般的な液体インピンに含まれる液体を陰イオン交換樹脂の付加を含みます。このメソッドは、遠心分離、ろ過、沈殿法などサンプル加工技術は、このよう?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、農業の保健及び安全性 (5U54OH008085) の CDC/NIOSH 高平原 Intermountain センターとコロラド州バイオ検出評価助成プログラム (14BGF 16) からの資金によって支えられました。
Materials
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
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