Rilevamento di virus da Bioaerosols utilizzando resina a scambio anionico
Summary
Un anione cambio metodo a base di resine, adattato a liquido basato su urto bioaerosol campionamento dei virus è dimostrato. Quando accoppiato con rilevazione molecolare a valle, il metodo consente facile e sensibile di rilevazione di virus da bioaerosols.
Abstract
Questo protocollo viene illustrato un metodo di campionamento di bioaerosol su misura per i virus. In questo sistema, resina a scambio anionico è accoppiata con dispositivi di prelievo di liquido aria basati su urto efficace concentrazione di virus caricati negativamente da bioaerosols. Così, la resina serve come un passo ulteriore concentrazione del flusso di lavoro di bioaerosol campionamento. Estrazione di acidi nucleici delle particelle virali viene quindi eseguita direttamente dalla resina a scambio ionico, con il campione risultante adatto per analisi molecolari. Inoltre, questo protocollo descrive una camera di bioaerosol su misura in grado di generare carichi di virus bioaerosols sotto una varietà di condizioni ambientali e consentendo per il monitoraggio continuo di variabili ambientali quali temperatura, umidità, velocità del vento e concentrazione di massa di aerosol. Il vantaggio principale dell’utilizzo di questo protocollo è aumento della sensibilità di rilevazione virale, come valutato tramite confronto diretto a un impinger liquido convenzionale non modificato. Altri vantaggi includono la possibilità di concentrare diversi virus caricati negativamente, il basso costo di resina a scambio anionico (~$0.14 per esempio) e la facilità d’uso. Gli svantaggi includono l’impossibilità di questo protocollo per valutare infettività delle particelle virali resina-adsorbito e potenzialmente la necessità per l’ottimizzazione del buffer campionamento liquido utilizzato all’interno del gorgogliatore.
Introduction
Lo scopo di questo metodo è quello di fornire una piattaforma di campionamento di bioaerosol altamente sensibile per facilitare la rilevazione molecolare del virus caricati negativamente da bioaerosols. Microrganismi, tra cui particelle virali, possono sopravvivere in bioaerosols per lunghi periodi di tempo1. Bioaerosols può viaggiare su distanze relativamente lunghe e mantenere la vitalità e l’infettività, come evidenziato da un focolaio di malattia dei Legionari che ha provenuto da torri si trova ad una distanza di 6 km da individui commoventi di raffreddamento industriale e ha provocato 18 vittime2. Trasmissione indiretta del virus agli esseri umani mediati da bioaerosols può verificarsi in diverse impostazioni ed è stato dimostrato per focolai di norovirus in scuole e ristoranti3,4. Allo stesso modo, bioaerosol trasmissione di virus può verificarsi in ambienti agricoli come negli allevamenti di suini e pollame, con questo itinerario di trasmissione viene considerato come un fattore importante nel movimento di virus tra produzione strutture5, 6 , 7 , 8 , 9.
Campionamento effettiva di carichi di virus bioaerosols consente un miglioramento nella diagnosi rapida e la preparazione per la prevenzione di scoppio, come mostrato nelle dimostrazioni in cui H5 dell’influenza un virus sono stati rilevati da bioaerosols in animale vivo mercati in Cina e la Stati Uniti10,11. Le attuali tecnologie di campionamento di bioaerosol implicano una serie di principi di cattura delle particelle differenti e possono essere categorizzate largamente in gorgogliatori, cicloni, simulazione e filtri12. Esula dall’ambito di questo protocollo per coprire esaustivamente tutti i vantaggi e gli svantaggi di queste piattaforme per il campionamento di virus da bioaerosols; Tuttavia, si può affermare che la maggior parte di questi dispositivi di campionamento non è stata ottimizzata per la raccolta di virus e batteriofagi13. Inoltre, infettività delle particelle virali è spesso negativamente colpiti, con liquidi gorgogliatori considerati per mantenere più efficacemente di campionamento dispositivi come dispositivi d’urto o filtri solido14infettività virale. Tuttavia, uno svantaggio di urto liquido è l’effetto di diluizione di destinazione, che si verifica perché i virus sono raccolti in volumi relativamente grande (in genere ≥ 20 mL) di liquido nel recipiente di raccolta. Un altro svantaggio importante coinvolge l’efficienza suboptimale di liquidi gorgogliatori di concentrare le particelle < 0,5 µM in dimensioni15. Tuttavia, l’efficienza di cattura di questi dispositivi può essere migliorata tramite immobilizzazione su matrici solide, come immobilizzazione può migliorare la conservazione degli acidi nucleici virali e infettività virale16,17.
Precedentemente abbiamo dimostrato che la resina a scambio anionico è uno strumento efficace per la cattura e la concentrazione di virus da matrici liquide, tra cui F-RNA batteriofagi, virus dell’epatite A, adenovirus umano e rotavirus18,19 ,20. Come definito dal costruttore, la resina a scambio anionico utilizzata in questo lavoro è una resina a scambio macroreticolari polistirene anionica altamente basica in cui funzionalizzati ammine quaternarie gruppi mediare attrazione e cattura di anioni in un liquido medio21 . Di conseguenza, la resina a scambio anionico è previsto di catturare i virus con cariche di superficie net-negativi, tra cui molti virus enterici, virus influenzali e altri virus rilevanti per la salute pubblica e degli animale.
Il protocollo attuale prevede l’aggiunta di resina a scambio anionico per un impinger liquido. In questo sistema, la resina serve come un passo di concentrazione secondaria per particelle virali catturato nel liquido gorgogliatore. Acidi nucleici può quindi essere eluiti direttamente in piccoli volumi, fornendo un campione concentrato per analisi molecolari. Così, il vantaggio principale di questo metodo è il miglioramento della sensibilità di rilevazione virale, principalmente attraverso la riduzione del volume del campione. Inoltre, a causa della cattura non specifico inerente di virus caricati negativamente, è probabile che il metodo applicabile per il rilevamento di un gran numero di virus di interesse. Qui, il metodo è dimostrato per i ceppi di vaccino del virus dell’influenza di tipo B e tipo A e il coliphage FRNA MS2 (MS2). Questi virus vengono successivamente rilevati tramite analisi standard qRT-PCR come descritto in precedenza22. L’utente finale non deve aspettarsi di incontrare difficoltà nell’esecuzione di questo metodo, perché le modifiche attualmente esistenti attrezzature non costituiscono gravi perturbazioni al flusso convenzionale di bioaerosol campionamento e analisi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per cattura sensibile virale da bioaerosols utilizzando modificate liquidi gorgogliatori. Il metodo è ottimizzato per il rilevamento e la quantificazione della carica virale in bioaerosols. La modifica specifica dimostrata qui prevede l’aggiunta di resina a scambio ionico a liquido contenuto all’interno di un comune impinger liquido. Questo metodo è stato sviluppato per la sua semplicità nel trattamento dei campioni a valle, mentre altre tecniche di elaborazione del campione come c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dal CDC/NIOSH High Plains Intermountain centro agricolo di salute e sicurezza (5U54OH008085) e il Colorado Bioscience Discovery valutazione Grant Program (14BGF-16).
Materials
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
References
- Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).
- Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers–how far can contaminated aerosols spread?. The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).
- Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).
- Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).
- Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8 (8), e71444 (2013).
- Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).
- Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10 (5), e0125401 (2015).
- Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).
- Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).
- Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).
- Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).
- Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121 (2017).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).
- Hogan, C. J. Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).
- Yu, K. -. P., Chen, Y. -. P., Gong, J. -. Y., Chen, Y. -. C., Cheng, C. -. C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
- Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).
- Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
- Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).
- Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
- Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).
- Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).
- Michen, B., Graule, T. Isoelectric points of viruses. Journal of Appled Microbiology. 109 (2), 388-397 (2010).
- Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).
- Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10 (8), e0134277 (2015).
